馬明杰，郭翠平，焦玉祥，呂佳泓，孫 振，張瑞華，陳君豪，謝之景，姜世金

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018）

1型鴨甲肝病毒LY0801株VP1基因在鴨胚傳代中的變異規(guī)律研究

馬明杰，郭翠平，焦玉祥，呂佳泓，孫 振，張瑞華，陳君豪，謝之景，姜世金

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018）

為了解1型鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus type 1）VP1基因在鴨胚傳代中的變異規(guī)律，本研究將LY0801株DHAV-1在鴨胚體內(nèi)傳代至30代，分別對(duì)1～5、10、15、20、25、30代病毒進(jìn)行VP1基因的克隆測(cè)序。各代次病毒分別以108copies/胚接種9日齡健康鴨胚，測(cè)定各組鴨胚的平均死亡時(shí)間和病毒在鴨胚尿囊液中的增殖拷貝數(shù)。結(jié)果表明：DHAV-1在鴨胚傳代過(guò)程中，不同代次之間出現(xiàn)12個(gè)氨基酸的反復(fù)變異和同步變異，分別為R43M（K）、T48A、T101S、L169F、T180I、S181L、R183Q、E184A（K）、G187D、D193N、M213R、H219Y；在傳代過(guò)程中，病毒致死鴨胚的時(shí)間逐漸延遲，但病毒在鴨胚內(nèi)的增殖拷貝數(shù)未呈現(xiàn)穩(wěn)定增長(zhǎng)的趨勢(shì)。

1型鴨甲肝病毒；VP1；變異；致弱

鴨病毒性肝炎（duck viral hepatitis，DVH）是一種由鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）感染導(dǎo)致的急性和高度致死性傳染病，可引起3周齡以下的雛鴨發(fā)生急性肝炎，病死率高，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的疫病之一[1]。DHV包括鴨甲肝病毒（duck hepatitis A virus,DHAV）和鴨星狀病毒（duck astrovirus,DAstV）。2009年，國(guó)際病毒分類委員第十次病毒分類報(bào)告將DHAV歸類為小RNA病毒科、禽肝病毒屬，目前為該屬唯一成員[2,3]。DHAV可分為A、B和C三個(gè)基因型，因?yàn)橄嗷ブg的交叉保護(hù)力很差，所以三個(gè)基因型分別對(duì)應(yīng)于三個(gè)血清型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3[4,5]。其中，DHAV-1和DHAV-3是我國(guó)的主要流行血清型[6,7]。

DHAV-1病毒基因組為長(zhǎng)度約7690 nt的單股正鏈RNA，由5′UTR、ORF、3′UTR和Poly-A尾巴組成[8]。基因組中的ORF編碼一個(gè)多聚蛋白（polyprotein），最終被切割成12 個(gè)成熟產(chǎn)物[9]。在小RNA 病毒中，結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP3 和VP1 位于病毒殼體的表面，參與病毒抗原位點(diǎn)的形成，其中VP1 蛋白作為主要的宿主保護(hù)蛋白，編碼主要的抗原位點(diǎn)并具有主要的型特異性中和位點(diǎn)，是決定病毒抗原性的主要成分[10,11]。

盡管針對(duì)鴨肝炎的診斷和防治已經(jīng)做了大量卓有成效的工作，但是在實(shí)際生產(chǎn)中該病仍然時(shí)有爆發(fā)，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害[12]。有研究認(rèn)為這可能與病毒在免疫壓力和外界環(huán)境因素的影響下發(fā)生的部分抗原變異有一定關(guān)系[13-15]。研究表明，DHAV-1經(jīng)鴨胚傳代后，出現(xiàn)毒力致弱的現(xiàn)象[16]。甘一迪等[17]通過(guò)對(duì)3株DHAV-1 VP1基因的克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)毒株的第49和183位氨基酸分別為T(mén)和H，而弱毒株對(duì)應(yīng)為S和Q。但是以上對(duì)DHAV-1的變異規(guī)律的研究?jī)H僅是根據(jù)從病鴨收集到的流行毒株來(lái)進(jìn)行比較研究的，由于這些病毒之間的系譜關(guān)系不清楚，因此很難準(zhǔn)確闡明VP1具體變異的規(guī)律。本研究在鴨胚上對(duì)病毒進(jìn)行傳代試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)VP1基因的克隆測(cè)序及毒力的測(cè)定，以期為深入了解DHAV-1的遺傳變異規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒本試驗(yàn)所用傳代毒株DHAV-1 LY0801為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物分子病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存，經(jīng)鑒定為強(qiáng)毒株，已完成全基因組序列的測(cè)定，GenBank登錄號(hào)：FJ436047。

1.2 主要儀器和試劑PCR相關(guān)試劑、克隆載體pMD18-T、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ均購(gòu)自TaKaRa 公司；病毒RNA 提取Trizol購(gòu)自北京博大泰克生物公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK公司；GoldStar Taqman One-Step RT-qPCRKit購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物合成參考GenBank收錄的DHAV-1的全基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增DHAV-1的VP1基因的引物，F(xiàn)VP1：5′- GGCATGTTGTCAATCGACTCAC TG-3′；RVP1：5′- GTCTCAACCTGATGAACCAT TGTAACTGG-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 DHAV-1 LY0801在鴨胚上的傳代無(wú)菌采集LY0801攻毒后的病死鴨肝臟，加滅菌生理鹽水，研磨，反復(fù)凍融3次，5000×g離心10 min，取上清用0.22 μm的一次性濾器過(guò)濾，加青霉素、鏈霉素（終濃度均為2000 IU/mL），37℃作用30 min左右。取無(wú)DVAH-1母源抗體的9日齡健康鴨胚，經(jīng)尿囊腔途徑接種鴨胚，接種量為0.2 mL/胚。鴨胚接種后繼續(xù)孵化，收獲24～96 h 死亡胚尿囊液，對(duì)應(yīng)接入下一批健康鴨胚，依此連續(xù)傳代30代，每隔5代對(duì)病毒進(jìn)行VP1基因序列測(cè)定。

1.5 各代VP1基因的測(cè)序與分析按病毒RNA提取試劑盒Trizol說(shuō)明書(shū)從尿囊液中提取病毒總RNA。利用引物列表中下游引物分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，反應(yīng)總體積20 μL，置于42℃ 60 min，72℃保溫15min。然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；95℃ 50 s，58℃ 50 s，72℃ 1 min 10 s，共32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄結(jié)果。PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行回收，并與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)序，每個(gè)代次測(cè)至少5個(gè)克隆，并與GenBank收錄的部分參考毒株進(jìn)行序列比對(duì)與分析，參考毒株見(jiàn)表1。

表1 本研究中用于序列比對(duì)的毒株Table 1 The DHAV-1 strains used for comparison in this study

1.6 不同代次病毒毒力的檢測(cè)分別將各代次病毒接種健康鴨胚，108copies/枚，每個(gè)代次的病毒接種10個(gè)鴨胚。統(tǒng)計(jì)24～120 h死亡的鴨胚，計(jì)算各組鴨胚的平均死亡時(shí)間。

1.7 不同代次病毒復(fù)制能力的檢測(cè)在各代病毒致死的鴨胚中，每一代次分別從死亡鴨胚中選擇4個(gè)不同時(shí)間死亡的鴨胚尿囊液，提取RNA，利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的Taqman探針熒光定量RT-PCR方法，對(duì)LY0801株DHAV-1不同代次的病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 LY0801株VP1基因的RT-PCR擴(kuò)增通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增DHAV-1LY0801株不同代次鴨胚傳代毒的VP1基因，電泳后均觀察到1 kb大小的核酸條帶，與預(yù)期大小一致，見(jiàn)圖1。

圖1 DHAV-1 VP1基因RT-PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 RT-PCR amplifi cation of VP1 gene of DHAV-1

2.2 鴨胚傳代毒的VP1序列測(cè)定及分析在鴨胚傳代過(guò)程中，LY0801株DHAV-1的VP1蛋白上出現(xiàn)了12個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，分別為R43M(K)、T48A、T101S、L169F、T180I、S181L、R183Q、E184A(K)、G187D、D193N、M213R和H219Y，并且不同代次病毒的這12個(gè)aa位點(diǎn)出現(xiàn)同步變異和反復(fù)變異現(xiàn)象，而不是點(diǎn)突變的積累（見(jiàn)圖2）。與不同毒力的毒?株序列進(jìn)行比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)鴨胚傳代后的氨基酸變異與病毒毒力有明顯相關(guān)性。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，所有DHAV-1毒株（包括弱毒株、人工致弱疫苗株、中等毒力毒株、自然分離強(qiáng)毒株以及傳代前后的LY0801株）VPl蛋白的第194～197位氨基酸均為保守SGD序列，與報(bào)道的FMDV Akesu/O/58細(xì)胞適應(yīng)株的細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)相同[22]。

圖2 DHAV-1 LY0801株鴨胚傳代各代次病毒VP1氨基酸序列與不同毒力參考株病毒的VP1序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Amino acid sequences alignment of the VP1 protein of different passages of LY0801 strain in duck embryo and DHAV-1 isolates

2.3 不同代次病毒的毒力檢測(cè)統(tǒng)計(jì)120 h內(nèi)死亡的鴨胚數(shù)目，并計(jì)算各代次病毒致死鴨胚的平均死亡時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著代次的增加，DHAV-1各代次病毒致死鴨胚的平均時(shí)間呈逐漸延長(zhǎng)的趨勢(shì)（表2 ）。

表2 不同代次病毒致死鴨胚的平均時(shí)間Table 2 The mean death time of duck embryos after being inoculated with different passages of virus

2.4 不同代次病毒的增值能力檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)表明，不同代次DHAV-1鴨胚尿囊液的病毒含量差異顯著，且并未呈現(xiàn)出適應(yīng)鴨胚后病毒拷貝數(shù)逐步穩(wěn)定增加的趨勢(shì)，但每一代病毒在不同時(shí)間致死鴨胚的病毒粒子拷貝數(shù)相近，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同代次病毒在致死鴨胚尿囊液的病毒含量Table 3 The viral content of different paaasages of DHAV-1 in duck embryo allantoic fl uid

3 討論

運(yùn)用Jameson-Wolf、Kyte-Doolitte、Emini和Karlus-Schulz方法對(duì)DHAV-1的VP1蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在VP1蛋白的132～137、 177～186、209～219氨基酸區(qū)域具有較好的親水性、表面可及性和較高的抗原指數(shù)，并且在二級(jí)結(jié)構(gòu)上含有易形成抗原表位的無(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角，表明VP1蛋白B 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位可能在此區(qū)域內(nèi)或者附近[18]。DHAV-1 VP1的變異主要集中在C末端高變區(qū)180～219位氨基酸[14,18,19]。本研究在DHAV-1鴨胚傳代不同代次的病毒中發(fā)現(xiàn)，VP1出現(xiàn)變異的12個(gè)氨基酸中，有8個(gè)（第180、181、183、184、187、193、213及219位氨基酸）位于高變區(qū)內(nèi)，6個(gè)位于177～186位和209～219位兩個(gè)預(yù)測(cè)的VP1蛋白B 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位上。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，上述8個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)均在其他天然毒株中存在（圖2）。已有研究表明這些位點(diǎn)的變異并未導(dǎo)致不同毒株之間交叉中和反應(yīng)的失敗和病毒毒力的變化[19]。因此推測(cè)LY0801株在鴨胚傳代中發(fā)生的這8個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變異至少并未導(dǎo)致DHAV-1主要中和性抗原表位和病毒毒力的改變。另外，第169位氨基酸出現(xiàn)的變異（L169F）只在LY0801株在鴨胚傳代后才出現(xiàn)，這一變異是否為毒株特異性變異以及其生物學(xué)功能仍然需要進(jìn)一步研究。

已有研究表明，將DHAV-1 強(qiáng)毒Q株在SPF雞胚中傳代可獲得毒力穩(wěn)定的致弱疫苗株[20]。本研究中各代次DHAV-1致死鴨胚的平均時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，顯示DHAV-1對(duì)鴨胚致死能力隨傳代次數(shù)的增加呈減弱的趨勢(shì)，但其VP1序列并沒(méi)有隨著鴨胚傳代而發(fā)生漸進(jìn)性突變，而是出現(xiàn)了反復(fù)變異的情況，并且12個(gè)氨基酸位點(diǎn)在不同的傳代毒株中呈現(xiàn)同步變異的現(xiàn)象，表明病毒的毒力與VP1的變異沒(méi)有明顯的相關(guān)性。本研究中，測(cè)序時(shí)每一代病毒均測(cè)定了5個(gè)克隆以上，結(jié)果顯示同代病毒VP1基因的序列是一致的，這表明每一代病毒中占優(yōu)勢(shì)的準(zhǔn)種是一致的。鴨胚作為發(fā)育中的生命體會(huì)對(duì)病毒感染產(chǎn)生相應(yīng)的免疫抵抗力，從而對(duì)病毒施加一定的免疫選擇壓的作用，但是由于鴨胚的個(gè)體差異性使這種選擇具有不定向性。我們?cè)邙喤呱蟼鞔钠渌麕字闐HAV-1，有3株也出現(xiàn)了與LY0801株類似的同步變異和反復(fù)變異現(xiàn)象，而另外2株則發(fā)生突變后非常穩(wěn)定，無(wú)反復(fù)變異現(xiàn)象（研究結(jié)果另文發(fā)表），這說(shuō)明出現(xiàn)反復(fù)變異與毒株的特異性有直接關(guān)系。同時(shí)，不同代次DHAV-1鴨胚尿囊液的病毒含量并未呈現(xiàn)出適應(yīng)鴨胚后逐步穩(wěn)定增加的趨勢(shì)，而表現(xiàn)為傳代第1、10、30代病毒拷貝數(shù)明顯高于其他代次的現(xiàn)象（表3），顯示鴨胚傳代至30代LY0801株 DHAV-1生物學(xué)特性并未穩(wěn)定。

在小RNA病毒科成員中，衣殼蛋白VPl上保守的RGD序列具有與細(xì)胞受體結(jié)合的功能，是病毒感染細(xì)胞的關(guān)鍵[21]。將口蹄病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）的SGD序列替換為RGD序列之后，F(xiàn)MDV在細(xì)胞中的增殖效率明顯增加[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，傳代前后的LY0801株及其他DHAV-1毒株的VPl基因中均存在SGD序列（圖2），與報(bào)道的Akesu/O/58細(xì)胞適應(yīng)株FMDV的細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)相同[23]。由于LY0801株DHAV-1在鴨胚傳代過(guò)程中VP1基因反復(fù)變異和生物學(xué)特性不穩(wěn)定，VP1中SGD序列的高度保守進(jìn)一步表明其可能在病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的過(guò)程中具有重要的生物學(xué)意義。

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GENETIC VARIATION OF VP1 GENE OF DUCK HEPATITIS A VIRUS TYPE 1 LY0801 STRAIN DURING REPEATED PASSAGES IN DUCK EMBRYOS

MA Ming-jie,GUO Cui-ping,JIAO Yu-xiang,LV Jia-hong,SUN Zhen,ZHANG Rui-hua,CHEN Jun-hao,XIE Zhi-jing,JIANG Shi-jin
(Shandong Province Key Laboratory of Animal Biotechnology and Disease Control and Prevention,College of Veterinary Medicine,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China)

To survey the genetic variation of VP1 gene of Duck hepatitis A virus type I (DHAV-I),DHAV-1 LY0801 isolate was carried 30 serial passages in duck embryos. The VP1 gene of the fi rst to fi fth,tenth,fi fteenth,twentieth,twenty-fi fth and thirtieth passages was amplifi ed and sequenced respectively. With the dose of 108copies per embryo,each ten 9-day-old healthy duck embryos were inoculated with different passages of virus,and the mean death time of each group and the vial copies in duck embryo allantoic fl uid were detected. The results showed that there were 12 amino acid mutation sites in VP1 gene in different passages,which were R43M(K),T48A,T101S,L169F,T180I,S181L,R183Q,E184A(K),G187D,D193N,M213R and H219Y. The 12 amino acid mutations appeared in different passages simultaneously and repeated the mutations in the first 30 passages. In the passaging process,the mean death time of duck embryos was increasing with increasing passage times,but the virus proliferation in duck embryos did not show a steady growth trend.

Duck hepatitis A virus tyre 1 (DHAV-1); VP1; mutation; attenuation

S852.659.6

A

1674-6422（2014）05-0021-07

2014-03-26

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2010GNC10914）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SDAIT-13-011-15）

馬明杰，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

姜世金，E-mail：sjjiang@sdau.edu.cn