程麗麗，許妍妍，張艷軍

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

·綜述·

中藥川烏多成分同時檢測及藥動學(xué)評價研究進(jìn)展*

程麗麗，許妍妍，張艷軍

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

川烏；多成分；質(zhì)量控制；藥動學(xué)

川烏為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的干燥母根，有大毒，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛之功效，常用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛等疾病的治療[1]。川烏化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有生物堿類成分，其中，二萜生物堿是川烏的特征有效成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、心血管及中樞神經(jīng)等方面的作用[2-7]。近年來，對二萜生物堿的國內(nèi)外研究報道較多，現(xiàn)主要從多種二萜生物堿成分的同時檢測、藥動學(xué)研究進(jìn)展等方面對其作一綜述。

1 二萜生物堿類化學(xué)成分

川烏中二萜生物堿具有顯著的生理活性。根據(jù)母核化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，二萜生物堿可以分為C18-、C19-、C20-以及雙二萜型[8]。目前，對于其化學(xué)成分的研究主要集中在C19-型生物堿，根據(jù)C19-型生物堿C8-、C14-位取代基的不同，可以分為雙酯型生物堿（DDAs）、單酯型生物堿（MDAs）以及醇胺型生物堿（ADAs）等[9]，川烏中幾種主要C19-二萜生物堿如表1所示[10-15]。具體見圖1、表1。

2 含量測定

目前，高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）等[16-19]現(xiàn)代分析技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中得到越來越廣泛的應(yīng)用。中藥飲片及其復(fù)方制劑中化學(xué)成分的復(fù)雜性決定了其多成分、多指標(biāo)同時檢測的必要性?！吨腥A人民共和國藥典》（2010年版）[1]采用HPLC法，通過控制雙酯型生物堿烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的總量限度來保證川烏藥材的質(zhì)量，而制川烏則通過控制雙酯型生物堿烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿及單酯型生物堿苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿的總量限度來保證制川烏的安全性、有效性。

圖1 川烏中C19-二萜生物堿基本結(jié)構(gòu)

表1 川烏中主要C19-二萜生物堿成分

有研究報道[20-22]，利用HPLC法建立了川烏、制川烏以及烏頭湯中3種雙酯型生物堿烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的定量分析方法，但采用了易破壞色譜柱固定相的強(qiáng)堿性流動相二乙胺、三乙胺，而且只實(shí)現(xiàn)了雙酯型生物堿的定量分析。張聿梅等[23]以A相[乙腈-四氫呋喃（25∶15）]-B相[0.1 mol/L醋酸銨]為流動相進(jìn)行梯度洗脫，建立了烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰新烏頭原堿5種烏頭類生物堿的定量分析方法，避免了二乙胺、三乙胺等強(qiáng)堿性流動相對色譜柱的損壞，并實(shí)現(xiàn)了雙酯型生物堿、單酯型生物堿的同時測定，為烏頭類藥材的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。程顯隆等[24]采用超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（RRLC-MS/MS法），建立了制川烏、制草烏、白附片、黑順片等烏頭類制品中微量雙酯型生物堿測定方法，該法靈敏度高，可滿足痕量生物堿的檢測需求。

定量檢測方法的建立為川烏飲片及其復(fù)方制劑的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。近年來，對川烏的研究結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地、不同批次、不同炮制工藝的飲片中，烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿的含量差異較大，藥材質(zhì)量參差不齊，因此，對川烏飲片及其復(fù)方制劑進(jìn)行內(nèi)在質(zhì)量控制非常必要。中藥指紋圖譜是一種建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價中藥材以及中藥制劑等質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性、穩(wěn)定性的綜合性、可量化的鑒定手段，現(xiàn)已成為建立現(xiàn)代中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的核心和基石之一。

劉敏[25]將HPLC含量測定和中藥指紋圖譜相結(jié)合，建立了雙酯型生物堿烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、全乙酰烏頭堿、全乙酰新烏頭堿的定量測定方法，并將中藥指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于炮制后飲片的質(zhì)量控制。有研究報道[26-27]，通過建立不同產(chǎn)地川烏的HPLC指紋圖譜，對烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿進(jìn)行了歸屬性鑒別，結(jié)果表明，中藥指紋圖譜能夠客觀反映川烏藥材及飲片的質(zhì)量，對于川烏質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

3 二萜生物堿藥動學(xué)評價研究

3.1 生物樣品的前處理生物樣品的前處理是采集、制備樣品后至關(guān)重要的樣品處理步驟，適宜的前處理方法是保證待測成分能夠完全提取的前提。生物樣品的前處理主要包括待測組分的純化和濃縮，從而使待測成分既與內(nèi)源性物質(zhì)、干擾性物質(zhì)盡可能分離，提高待測成分的靈敏度、專屬性，也能夠減少雜質(zhì)對儀器的污染、損耗。近年來，對于含有烏頭類二萜生物堿的生物樣品（包括血液、尿液、糞便、膽汁等）的前處理主要有以下幾種方法。

3.1.1 沉淀蛋白法沉淀蛋白法用于除去生物樣品中的非必要成分，減少雜質(zhì)對待測成分的干擾以及對色譜柱的堵塞等。通常沉淀蛋白法主要包括鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、非離子多聚體沉淀法、生成鹽復(fù)合物沉淀法以及熱變性、酸堿變性沉淀法等。

可用于沉淀蛋白的溶劑有乙腈、甲醇、丙酮等[28-30]，含二萜生物堿生物樣品常用乙腈（含1%三氯乙酸）、乙腈、甲醇、丙酮等溶劑沉淀蛋白，該方法操作簡單，檢測用量少，使用溶劑少，降低了成本，減少了溶劑的危害，快速準(zhǔn)確，靈敏可靠。

3.1.2 液液萃取法烏頭類二萜生物堿為脂溶性生物堿，在適當(dāng)?shù)娜軇┲械娜芙舛却笥谒嘀械娜芙舛?，而血樣、尿樣等生物樣品中含有的大多?shù)內(nèi)源性雜質(zhì)為強(qiáng)極性的水溶性雜質(zhì)，因而用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑萃取可除去大部分雜質(zhì)。該方法在烏頭類二萜生物堿的生物樣品測定中得到了廣泛的應(yīng)用，常采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等[31-33]有機(jī)試劑對樣品進(jìn)行萃取，具有操作簡單、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，但有可能產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，引起藥物的損失，從而使回收率降低。

3.1.3 固相萃取法固相萃取法是近十幾年來在生物樣品純化中被廣泛采用的方法，即將具有吸附、分配及離子交換性質(zhì)的、表面積大的擔(dān)體作為萃取劑填入小柱，以溶劑淋洗后，將生物樣品通過，使藥物或雜質(zhì)保留在擔(dān)體上，用適當(dāng)溶劑洗去雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑將藥物洗脫下來。采用固相萃取法[34-37]對含有烏頭類二萜生物堿的血樣、尿樣進(jìn)行前處理，結(jié)果表明該方法速度快，無乳化現(xiàn)象，能夠?qū)χ兴幎喑煞滞瑫r提取，提取率較高，但也有小柱價格相對昂貴等缺點(diǎn)，增加了檢測的成本。

3.2 二萜生物堿在體內(nèi)的藥動學(xué)行為特征中藥飲片及復(fù)方制劑中含有多種有效成分，因此，多成分藥動學(xué)研究對于提高中藥研究水平及指導(dǎo)臨床合理用藥等具有重要意義[38]。目前，對于川烏二萜生物堿的藥動學(xué)研究主要集中在雙酯型生物堿烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿上。

通過研究次烏頭堿在正常大鼠、虛熱大鼠以及虛寒大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，次烏頭堿在虛熱大鼠體內(nèi)的達(dá)峰速度快于正常大鼠和虛寒大鼠，且在虛寒大鼠和虛熱大鼠體內(nèi)的最大血藥濃度高于正常大鼠，表明次烏頭堿在不同狀態(tài)大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)有差異，次烏頭堿對于虛寒狀態(tài)是對癥治療，對于虛熱狀態(tài)是反證，對于正常狀態(tài)作用強(qiáng)烈表現(xiàn)毒性，為“辨證論治，對癥下藥”、“毒藥之于常人為有毒，對病患則治病”等傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論提供了有力佐證[31]。

肖鳳霞等[39]給予SD大鼠按1.8 g/kg尾靜脈注射四逆湯制劑，結(jié)果顯示，四逆湯制劑中烏頭類生物堿在大鼠體內(nèi)呈一級動力學(xué)消除，符合靜脈注射后的開放一房室模型，半衰期為0.932 01 h。武潔等[40]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)3種生物堿吸收迅速，且達(dá)峰時間及半衰期無明顯差異，表明3種生物堿在大鼠體內(nèi)的吸收和消除速率基本一致。何雷萍等[41]經(jīng)口給予大鼠單味附子湯劑后，其中烏頭堿的tmax、MRT0-t與王朝虹等[34]進(jìn)行的大鼠經(jīng)口給予烏頭堿單體藥動學(xué)研究所得結(jié)果相近，但與不同藥材配伍后，tmax、MRT0-t均發(fā)生變化，說明單一藥材某化學(xué)成分的藥動學(xué)與復(fù)方該化學(xué)成分的藥動學(xué)存在差異，復(fù)方中配伍組藥材可能對烏頭堿類生物堿的吸收產(chǎn)生影響，臨床用藥多以復(fù)方為主，因此，以復(fù)方為研究對象，并考慮復(fù)方中的配伍比例等方面，方能得到更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，從而為臨床治療提供用藥指導(dǎo)。

3.3 二萜生物堿的代謝目前，對川烏的體內(nèi)代謝研究主要集中在對生物堿單體成分的研究上，其中血液、尿液等是代謝物鑒定的首選檢材。

3.3.1 二萜生物堿在血液中的代謝產(chǎn)物研究有研究報道[35，42]，從中毒死亡7 d的家兔血液中發(fā)現(xiàn)了烏頭堿及其3種代謝產(chǎn)物，其中，16-O-去甲基苯甲酰烏頭原堿為首次在口服烏頭堿動物血液中發(fā)現(xiàn)，可能代謝途徑為烏頭堿在體內(nèi)降解為苯甲酰烏頭原堿，苯甲酰烏頭原堿則可繼續(xù)降解為代謝產(chǎn)物烏頭原堿和16-O-去甲基苯甲酰烏頭原堿。

3.3.2 二萜生物堿在尿液中的代謝產(chǎn)物研究通過研究烏頭堿灌胃給藥后0～4 h、4～8 h兩個時間段內(nèi)家兔尿液中烏頭堿的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)兩個時間段內(nèi)代謝產(chǎn)物相同，但含量上差別很大[32]。孫瑩等[36]研究了不同性別家兔尿液中烏頭堿的代謝產(chǎn)物，檢測到烏頭堿、烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、16-O-去甲基苯甲酰烏頭原堿、16-O-去甲基烏頭堿，并從雄性兔尿中檢測到去乙酸烏頭堿，表明不同給藥方式、不同性別的受試動物，烏頭堿的代謝產(chǎn)物不同，而灌胃給藥后同一受試動物在不同時段的尿液代謝產(chǎn)物只有含量上的區(qū)別，沒有質(zhì)的不同。

陳蘋蘋等[37,43]研究了新烏頭堿在大鼠尿液中的主要代謝產(chǎn)物，共發(fā)現(xiàn)了原形藥物以及苯甲酰新烏頭原堿葡糖醛酸結(jié)合物、10-羥基新烏頭堿、1-O-去甲基新烏頭堿、去氧新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿等5個代謝產(chǎn)物，其中，苯甲酰新烏頭原堿葡糖醛酸結(jié)合物（m/z 766）為首次發(fā)現(xiàn)的新烏頭堿在大鼠體內(nèi)的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。分別灌胃給予大鼠烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品和四逆湯，連續(xù)收集尿液24 h，在給予烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品的大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)了烏頭堿原形藥物和10個代謝產(chǎn)物，其中，苯甲酰烏頭原堿葡萄糖醛酸結(jié)合物（m/z 780）、烏頭堿硫酸結(jié)合物（m/z 726）為首次發(fā)現(xiàn)的烏頭堿在大鼠體內(nèi)的Ⅱ相代謝物；在給予四逆湯的大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)了烏頭堿原形藥物和8個代謝產(chǎn)物，與烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品直接給藥相比，出現(xiàn)了新的次堿代謝物，表明配伍后制劑中的烏頭堿與單一成分代謝途徑有差異。

梁峰等[44]通過研究不同給藥方式下家兔尿液中的烏頭堿代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，靜脈給藥組尿液中除原形藥物外，主要有1種代謝產(chǎn)物16-O-去甲基烏頭堿，灌胃給藥組除原形藥物外主要有2種代謝產(chǎn)物：16-O-去甲基烏頭堿和烏頭堿去氧去甲基產(chǎn)物，烏頭堿去氧去甲基產(chǎn)物結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步確認(rèn)。

3.3.3 二萜生物堿在肝臟及消化道中的代謝產(chǎn)物研究肝臟是鑒定烏頭堿中毒最好的檢材之一。肝微粒體細(xì)胞色素P450酶是體內(nèi)主要參與藥物代謝的酶，其活性的高低直接影響到藥物的藥理作用，研究報道[45]，半夏、瓜蔞、貝母、白蘞、白及與川烏配伍后，大鼠體內(nèi)P450酶含量發(fā)生變化，表明配伍組對川烏的體內(nèi)代謝產(chǎn)生影響。張洪貴等[42]研究了不同性別、不同死亡時間的家兔肝臟內(nèi)烏頭堿代謝產(chǎn)物，可檢測有標(biāo)記意義的代謝產(chǎn)物逆證烏頭堿中毒，為烏頭堿中毒的法醫(yī)鑒定及臨床檢驗(yàn)提供參考。

隨志剛等[33]通過研究家兔腸道內(nèi)的烏頭堿代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，給藥后家兔小腸內(nèi)容物中檢測到烏頭堿和16-O-去甲基-8-O-去乙酰基烏頭堿、8-O-去乙?；鶠躅^堿、16-O-去甲基烏頭堿、去氧烏頭堿、印烏頭堿等5個代謝產(chǎn)物，盲腸中檢測到烏頭堿和8-O-去乙?；鶠躅^堿、16-O-去甲基烏頭堿、去氧烏頭堿、印烏頭堿等4個代謝產(chǎn)物，糞便中只檢測到烏頭堿和代謝產(chǎn)物16-O-去甲基烏頭堿，并通過對比實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，認(rèn)為16-O-去甲基烏頭堿是烏頭堿的主要代謝產(chǎn)物。

4 結(jié)語

中藥質(zhì)量控制與中藥藥動學(xué)研究的最終目的是保證用藥的安全性和有效性。目前，不同產(chǎn)地或不同批次的川烏藥材中化學(xué)成分含量差異較大，質(zhì)量參差不齊，《中華人民共和國藥典》（2010年版）采用雙酯型生物堿烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的含量來評價該類藥材的質(zhì)量，文獻(xiàn)中多以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿或?yàn)躅^堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿含量來保證藥材的安全、有效。同時，中藥指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用使得川烏的質(zhì)量評價研究更加全面，因此，制定川烏藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有利于保證該藥材的安全性、有效性。

川烏化學(xué)成分在體內(nèi)的藥動學(xué)研究比較復(fù)雜，對雙酯型生物堿烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的研究結(jié)果表明，烏頭堿類生物堿在體內(nèi)吸收迅速，且含川烏的復(fù)方中，配伍組藥材可能對烏頭堿類生物堿的吸收產(chǎn)生影響，因此，對于復(fù)方中川烏成分的藥動學(xué)研究，應(yīng)考慮配伍藥材、配伍比例等對川烏化學(xué)成分的體內(nèi)過程影響，從而為臨床治療提供用藥指導(dǎo)。

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A

1673－9043（2014）01－0056-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.01.19

2013-10-10）

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）資助項目（2011CB505300，2011CB505302）。

程麗麗（1987-），女，碩士研究生，主要從事中藥分析及藥代動力學(xué)研究。

張艷軍，E-mail:zyjsunye@163.com。