鄒榮軍，梁祖鳳，馬騰飛，唐新宇，呂 紅綜述，田 晶，齊 玲審校 (吉林醫(yī)藥學(xué)院:.0級(jí)臨床本科班，.0級(jí)預(yù)防醫(yī)學(xué)本科班，3.生理教研室，.病理教研室，吉林 吉林 303)

缺血性腦血管疾病因其發(fā)病率、致殘率和致死率高，與心臟病和惡性腫瘤一同構(gòu)成了人類最常見的三大致死性疾病。近年來，缺血性腦血管疾病的發(fā)病率各年齡層中均呈不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)。在腦缺血疾病中神經(jīng)細(xì)胞凋亡后所引起的腦損傷發(fā)揮著重要的作用，這是缺血性腦損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一[1-2]。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是指在某些生理或病理因素的刺激下，細(xì)胞膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被激活，進(jìn)而啟動(dòng)相關(guān)凋亡調(diào)控因子，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過程。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是由凋亡因素的激活和抗凋亡因素的抑制兩方面來共同決定的。而線粒體作為重要的能量供應(yīng)器，在凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用[3]。

1 神經(jīng)細(xì)胞凋亡與缺血性腦血管病

神經(jīng)細(xì)胞凋亡是一個(gè)程序性細(xì)胞死亡的過程，主要經(jīng)歷了3個(gè)時(shí)期[4]：第一個(gè)時(shí)期是起始期，靶細(xì)胞接受死亡指令，開始啟動(dòng)相關(guān)因子，同時(shí)抑制某些因子從而發(fā)動(dòng)程序性死亡；第二個(gè)時(shí)期是整合期，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)一系列的形態(tài)和生化變化，如核凝集、胞體縮小、染色體DNA降解、形成DNA小片段等；第三個(gè)時(shí)期是執(zhí)行期，形成的凋亡小體被周圍組織的吞噬細(xì)胞消化吞噬，完成了整個(gè)凋亡過程。神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有其特定的通路，其中主要包括死亡受體介導(dǎo)通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[5]。

大量學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了神經(jīng)細(xì)胞凋亡與腦缺血性腦血管病發(fā)生發(fā)展呈密切相關(guān)。如Jadas V等[6]通過對(duì)30名新生兒腦病的兒童進(jìn)行MRI檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這群兒童的大腦實(shí)質(zhì)均有組織細(xì)胞凋亡的跡象，猜想這可能與胎兒期臍帶纏繞或是藥物作用導(dǎo)致胎兒腦組織缺血缺氧而發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。Yu Ji Hea等[7]通過對(duì)腦血管病變損傷引起的缺血性腦病的大鼠注射促紅細(xì)胞生成素和粒細(xì)胞集落刺激因子后，發(fā)現(xiàn)通過改善神經(jīng)細(xì)胞氧利用和攝取能力，可以抵抗神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對(duì)于缺血性腦病可以發(fā)揮一定的治療作用。Mehta等[8]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦組織發(fā)生缺血損傷后，缺血中心區(qū)細(xì)胞主要以壞死為主，缺血周圍區(qū)細(xì)胞則以凋亡為主。

細(xì)胞一旦發(fā)生壞死是難以逆轉(zhuǎn)的，但凋亡是可以通過上游信號(hào)調(diào)節(jié)進(jìn)行干預(yù)的，因此，腦缺血的治療策略正是以減少凋亡細(xì)胞數(shù)目和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的活性為目標(biāo)。

2 線粒體通路的研究進(jìn)展

線粒體通路是細(xì)胞凋亡的一條重要途徑。當(dāng)各種損傷因子使線粒體正常的結(jié)構(gòu)受到破壞，線粒體出現(xiàn)腫脹變形，嵴彎曲，膜破裂、減少或缺損，基質(zhì)外流后導(dǎo)致某些凋亡蛋白釋放，進(jìn)而激活下游的凋亡調(diào)控因子，細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體通路引起凋亡的發(fā)生主要與B細(xì)胞淋巴瘤蛋白-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)家族促凋亡蛋白增多[9-10]、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity pore，MPTP)開放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl asparate specific proteinase，caspase)激活等因素有關(guān)。

2.1 Bcl-2家族促凋亡蛋白

Bcl-2家族是目前最受關(guān)注的凋亡相關(guān)蛋白家族，可分為抗凋亡成員和促凋亡成員。抗凋亡成員包括Bcl-2、Bcl-xl、bfl-1/Al等，它們主要作用于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜；促凋亡成員主要包括Bax、Bak和Bad等，主要是抵消抗凋亡蛋白所形成的異源二聚體阻止細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)釋放的作用，間接促進(jìn)凋亡[11]。Bcl-2和Bax在細(xì)胞內(nèi)組成了一個(gè)平衡體系，共同受凋亡因子的調(diào)控。Bax增高可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2增高則抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí)Bax和Bcl-2相互作用既可以形成同源二聚體，也可以形成異源二聚體；當(dāng)形成同源二聚體時(shí)可阻止MPTP的開放。

在正常生理情況下，細(xì)胞通過表達(dá)Bcl-2來介導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)谷胱甘肽的聚集，抵消細(xì)胞內(nèi)損傷因子的氧化刺激，改變了細(xì)胞核內(nèi)氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)的平衡；同時(shí)也作用于線粒體膜，使膜穩(wěn)定、防止促凋亡相關(guān)蛋白釋放，阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放而對(duì)細(xì)胞起一定保護(hù)作用[12]。在神經(jīng)細(xì)胞中，當(dāng)有凋亡因素的誘導(dǎo)作用時(shí)，Bax就會(huì)從胞液遷移至線粒體外膜，與Bcl-2形成異源二聚體從而介導(dǎo)線粒體外膜形成孔道，使氧自由基增多、Ca2+超載、CytC等凋亡蛋白釋放從，而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13]。

2.2 MPTP的開放

線粒體膜通透性主要受MPTP的開放與關(guān)閉來控制[14]。MPTP是由位于線粒體內(nèi)膜的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位子(adenine nucleotide translocator，ANT)和位于外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)組成。其中VDAC是線粒體進(jìn)行ATP、ADP等物質(zhì)交換的重要通道，表面有許多蛋白酶、凋亡相關(guān)蛋白的受體，如Bax、Bcl-2、Bcl-xl等；ANT主要感受線粒體基質(zhì)內(nèi)氧自由基、Ca2+濃度、pH等的刺激，同時(shí)在其側(cè)面還有具有折疊酶活性的重組人親環(huán)素D(HumanCyclophilin-D，CypD)。

在正常生理狀況下，MPTP受Bcl-2為主的抗凋亡蛋白和Bax為主的促凋亡蛋白的共同調(diào)節(jié)。當(dāng)Bax與線粒體膜上的Bcl-2結(jié)合后形成同源二聚體，主要作用于VADC以阻止MPTP的開放；當(dāng)細(xì)胞受到損傷刺激后將會(huì)出現(xiàn)一系列的病理改變。一方面，線粒體可通過呼吸鏈生成大量氧自由基，直接作用于線粒體內(nèi)膜使膜電位降低，CypD發(fā)揮折疊效應(yīng)使蛋白折疊并聚集于親水面，這種蛋白的折疊聚集主要是為了控制溶質(zhì)分子穿入線粒體膜。在損傷程度輕時(shí)這種以CypD為主的折疊蛋白形成的復(fù)合物尚能夠維持MPTP孔處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到一定閾值后，線粒體孔道開放，導(dǎo)致線粒體嵴破裂、腫脹變大、CytC釋放，這是線粒體可控性開放；但是當(dāng)有高濃度的誘導(dǎo)物直接刺激作用時(shí)，MPTP孔會(huì)直接打開進(jìn)入不可控性開放，而且這個(gè)過程不受Ca2+的調(diào)控[15-16]。另一方面，Bid、Bad等促凋亡蛋白在達(dá)到一定濃度閾值時(shí)能直接或間接誘導(dǎo)Bax、Bak發(fā)生構(gòu)象變化，通過暴露跨膜閾而易位到線粒體外膜上并在外膜上聚集形成脂質(zhì)孔，使MPTP開放異常、通透性增加、線粒體膨脹[17-18]。最終導(dǎo)致CytC、凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis-inducing factor，AIF)等的釋放，之后激活caspase-9[19-20]，并在ATP作用下聚集結(jié)合形成凋亡復(fù)合物，最終激活caspase-3引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞凋亡發(fā)生[21-24]。

2.3 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族蛋白

caspases是直接引起細(xì)胞凋亡的蛋白酶系統(tǒng)，在凋亡路徑中發(fā)揮了重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)有14個(gè)Caspase家族成員，其中caspase-3、caspase-8及caspase-9是凋亡通路上的三個(gè)關(guān)鍵因子。caspase-3能夠特異性地裂解天冬氨酸殘基后的肽鍵，參與凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)；在caspases“級(jí)聯(lián)效應(yīng)”中位于下游，是凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中最關(guān)鍵的執(zhí)行者[25]。

當(dāng)細(xì)胞受到損傷刺激后，細(xì)胞內(nèi)的caspase-8、caspase-9前體被激活從而激活了caspase-3前體，隨之細(xì)胞進(jìn)入caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，凋亡發(fā)生。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)caspase-9能激活所有的caspase家族成員[26-27]。由于xcaspase-3在細(xì)胞凋亡中地位的重要和特殊，在實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中常常將caspase-3作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)記[4]。在研究線粒體凋亡通路時(shí)將caspase-3和caspase-9共同作為標(biāo)記物則更有意義。

3 線粒體通路與神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)重要的雙膜細(xì)胞器，其內(nèi)膜和外膜系統(tǒng)將線粒體分為四部分，即外膜、內(nèi)膜、膜間隙和基質(zhì)。這四部分一方面通過氧化磷酸化等代謝途徑為細(xì)胞提供ATP；另一方面參與啟動(dòng)凋亡，特別是膜間隙中的某些蛋白，如Cyt C、 脫氧核糖核酸酶、核酸內(nèi)切酶G和AIF等。

大量研究發(fā)現(xiàn)，線粒體損傷后激活線粒體凋亡傳導(dǎo)通路在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用。線粒體損傷在腦缺血疾病中體現(xiàn)的特別明顯，比如張潔[28]通過對(duì)大鼠行雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)結(jié)扎并降壓4周后建立血管性癡呆模型，發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)線粒體出現(xiàn)明顯的腫脹、破壞。袁燕[29]通過取大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，并給予一定劑量的鎘使其對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性損傷，發(fā)現(xiàn)在凋亡過程中神經(jīng)細(xì)胞線粒體腫脹變形，嵴彎曲變形，膜發(fā)生破裂、減少或缺損，基質(zhì)外流，并且線粒體參與了大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。馮金洲[30]在實(shí)驗(yàn)中建立了小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎模型，通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其脊髓神經(jīng)元內(nèi)線粒體出現(xiàn)明顯腫脹、空泡樣變甚至溶解等；發(fā)現(xiàn)線粒體通過非免疫損傷機(jī)制參與細(xì)胞的凋亡過程。而李妍[31]在證實(shí)錳對(duì)多巴胺神經(jīng)元毒性作用的過程中發(fā)現(xiàn)，其主要的損傷機(jī)制是其阻礙線粒體的電子傳遞鏈，使其自氧化而進(jìn)入凋亡過程。

通過保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞線粒體的功能和結(jié)構(gòu)，就能發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯、白附子提取物、三七總皂苷等通過直接清除氧自由基，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的線粒體可以發(fā)揮直接抗凋亡的作用[32-34]。海風(fēng)藤和姜黃素等可以通過穩(wěn)定線粒體膜電位，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)而起到抗凋亡的作用[35-36]。山楂葉總黃酮和黃芪等通過抑制一系列酶的活性而減少細(xì)胞色素C的釋放來保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[37-38]。

由此可見治療和預(yù)防缺血性腦損傷疾病的發(fā)生中，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定來抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡是我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究和藥物作用的重要靶點(diǎn)。

4 展 望

綜上所述，神經(jīng)細(xì)胞凋亡與缺血性腦損傷疾病發(fā)生密切相關(guān)，在凋亡發(fā)生過程中線粒體凋亡傳導(dǎo)通路的激活是凋亡發(fā)生的重要原因。通過對(duì)線粒體通路的研究可以加深我們對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的認(rèn)識(shí)，對(duì)缺血性腦損傷疾病的原因有更好的了解，更重要的是可為臨床治療及預(yù)防提供重要的理論基礎(chǔ)。隨著分子手段和基因治療的發(fā)展，我們相信在未來的某一天這類缺血性腦損傷疾病的治愈率將能大大提高。

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