柴仲秋，劉 維，周 冰

(1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2．天津市濱海新區(qū)塘沽中醫(yī)醫(yī)院，天津300450;3．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193)

大腸癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率居第3位［1］，具有高復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性。隨著綜合治療方案研究的日益深入，整體觀念指導(dǎo)下的中醫(yī)辨證論治逐漸成為大腸癌治療方案中不可忽視的一環(huán)，其積極作用也日益顯現(xiàn)。然而中醫(yī)辨證繁雜、模糊、難以掌握也成為制約大腸癌中醫(yī)治療進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸。因此，運(yùn)用現(xiàn)代研究方法揭示大腸癌證候本質(zhì)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

系統(tǒng)生物學(xué)方法的運(yùn)用［2］以及證候相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志研究不斷涌現(xiàn)［3］。而后基因組時(shí)代的到來(lái)為證候本質(zhì)的研究提供了新的研究思路和技術(shù)平臺(tái)。蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)不同時(shí)間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體進(jìn)行研究，能夠從整體水平反應(yīng)疾病過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程，與中醫(yī)辨證論治的認(rèn)識(shí)論和方法論具有極大的相似性。目前已有應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)初步探討冠心?。?-6］、肝纖維化［7］、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［8］以及子宮內(nèi)膜異位癥［9］等疾病的中醫(yī)證候本質(zhì)的報(bào)道。該項(xiàng)技術(shù)日益廣泛的應(yīng)用也為大腸癌中醫(yī)證候本質(zhì)的研究提供了新思路和新方法。課題組成員為了總結(jié)和分析蛋白質(zhì)組學(xué)在大腸癌中醫(yī)證候本質(zhì)研究中的應(yīng)用情況，對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了系統(tǒng)檢索和梳理。

1 文獻(xiàn)檢索策略及方法

設(shè)立1974年01月至2013年11月為檢索時(shí)間段。選擇“腸癌/腸腫瘤”“蛋白質(zhì)組學(xué)”“證候”“中醫(yī)客觀化”“辨證”為關(guān)鍵詞制定檢索策略，檢索中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(CBM)、中文生物醫(yī)學(xué)期刊目次數(shù)據(jù)庫(kù)(CMCC)、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)(生物醫(yī)藥信息版)、中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)及萬(wàn)方數(shù)據(jù)等中文數(shù)據(jù)庫(kù)。以“colorectal cancer”O(jiān)R“colon cancer”O(jiān)R“rectal cancer”O(jiān)R“colorectal carcinoma”O(jiān)R“colon carcinoma”O(jiān)R“rectal carcinoma”O(jiān)R“colorectal tumor”O(jiān)R“colon tumor”O(jiān)R“rectal tumor”O(jiān)R“colorectal neoplasm”O(jiān)R“colon neoplasm”O(jiān)R“rectal neoplasm”“proteomics”“Chinese medicine”“syndrome differentiation”為關(guān)鍵詞制定檢索策略，檢索PubMed、荷蘭醫(yī)學(xué)文摘(EMbase)等英文數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合計(jì)算機(jī)初篩及人工手檢共篩選出密切相關(guān)文獻(xiàn)5篇。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在大腸癌中醫(yī)證候本質(zhì)研究中的應(yīng)用報(bào)道

周小軍等［10-12］應(yīng)用雙向凝膠電泳分離大腸癌組織蛋白質(zhì)，通過(guò)銀染，PDQuest 2-DE軟件分析，篩選差異蛋白質(zhì)點(diǎn)并進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析，測(cè)定膠內(nèi)酶解后的肽質(zhì)指紋圖譜，通過(guò)查詢(xún)SWISS-PROT、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定差異蛋白質(zhì)。運(yùn)用這一方法其先后比較了濕熱蘊(yùn)結(jié)證、氣血虧虛證大腸癌患者腫瘤組織之間的差異蛋白質(zhì)，以及2組患者與正常人結(jié)腸黏膜組織的差異蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示:3組之間的差異表達(dá)蛋白主要集中在熱休克蛋白(HSP)、細(xì)胞骨架蛋白、抗氧化蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白、能量產(chǎn)生相關(guān)蛋白、血液蛋白等。

趙海燕等［13］應(yīng)用雙向凝膠電泳分離大腸癌姑息治療期血瘀組、氣血虧虛組及健康組人群的血清蛋白，然后經(jīng)不同波長(zhǎng)光激發(fā)掃描得到不同樣品的蛋白質(zhì)組圖譜，經(jīng)DeCyder Image QuantTMV 6.5軟件分析，選擇血瘀組與健康組和氣血虧虛組相差達(dá)1.15倍以上的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果最終確定了10個(gè)差異蛋白質(zhì)。其中血瘀組較健康組和氣血虧虛組蛋白質(zhì)表達(dá)量均上調(diào)的4個(gè):IL-8、維生素D結(jié)合蛋白前體、β-GDP解離抑制因子、α-二酯酰甘油激酶;均下調(diào)的1個(gè)為纖維結(jié)合蛋白(FN);有3個(gè)較健康組上調(diào)而較氣血虧虛組下調(diào):腫瘤基因DJ-1、載脂蛋白A-I前體、軟骨關(guān)聯(lián)性蛋白前體;有2個(gè)較健康組下調(diào)、而較氣血虧虛組上調(diào):ADP核糖基化類(lèi)蛋白15、血清淀粉樣蛋白A。

3 討論

“證”是疾病發(fā)展過(guò)程中某一階段的病理概括，從中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)的角度，中醫(yī)證候本質(zhì)是指引起證發(fā)生發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，這些物質(zhì)決定著證的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。蛋白質(zhì)是人體功能表現(xiàn)的物質(zhì)載體，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析證之間的差異蛋白，為中醫(yī)證候本質(zhì)研究提供了一條新的途徑。

將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于大腸癌證候本質(zhì)的研究中，其結(jié)果初步反應(yīng)了部分癥狀的物質(zhì)基礎(chǔ)，為證候的外在表現(xiàn)與內(nèi)在本質(zhì)建立了溝通的橋梁，但仍然存在一些問(wèn)題需要進(jìn)一步探討。

3.1 證候辨識(shí)的客觀與規(guī)范 由于疾病本身以及中醫(yī)診斷的復(fù)雜性，目前尚未有全國(guó)公認(rèn)的大腸癌證型診斷標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái)有關(guān)大腸癌證候研究的文獻(xiàn)中應(yīng)用的參考標(biāo)準(zhǔn)包括《中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》《中醫(yī)病證分類(lèi)與代碼》《中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)·證候部分》《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》《中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn):中醫(yī)肛腸科常見(jiàn)病診療指南》以及《中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn):腫瘤中醫(yī)診療指南》等。此外，還有以癥狀調(diào)查為基礎(chǔ)，通過(guò)頻數(shù)分析［14］、因子分析及聚類(lèi)分析［15］等統(tǒng)計(jì)方法探索大腸癌辨證分型的報(bào)道，這些方法均是對(duì)證候客觀辨識(shí)的有益嘗試，但受到樣本量及證候調(diào)查客觀化的限制仍難以廣泛推廣。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的改進(jìn) 蛋白質(zhì)組學(xué)作為一個(gè)生物工程，其研究非常艱巨。但隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的建立，使同時(shí)分離數(shù)千種蛋白質(zhì)的技術(shù)成為現(xiàn)實(shí)，減少了由于樣本成分復(fù)雜而造成的干擾或個(gè)體差異，提高了樣本的均一性和復(fù)雜性，又保持了多樣品、多蛋白的同時(shí)分析，從而把每個(gè)蛋白放在一個(gè)具有相互參照的背景里?？梢?jiàn)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將為證本質(zhì)的研究提供技術(shù)支持。目前已發(fā)表的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究大腸癌證候本質(zhì)的報(bào)道中主要應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)和生物質(zhì)譜(MS)分析技術(shù)。洪朝金等［16］認(rèn)為表面增強(qiáng)激光解析電離-飛行-質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)較傳統(tǒng)的二維凝膠電泳相比，具有樣品需要量少，可發(fā)現(xiàn)多種方式的組合蛋白質(zhì)譜，可直接用粗樣本進(jìn)行檢測(cè)，獲得的圖譜單一、重復(fù)性好，可以分析二維凝膠電泳無(wú)法分析的蛋白質(zhì)，包括疏水、跨膜等電點(diǎn)及低分子量蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，更有利于大腸癌證候的本質(zhì)研究。此外，同位素標(biāo)記技術(shù)目前已開(kāi)始在其他疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。覃慧嬋等［17］應(yīng)用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)篩選了肺腺癌的血漿生物標(biāo)志物?；谕凰貥?biāo)記的蛋白質(zhì)定量技術(shù)比非同位素標(biāo)記定量的準(zhǔn)確性更高，同時(shí)聯(lián)用液相色譜分離技術(shù)，在蛋白質(zhì)疏水性、相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)方面的局限小，能夠有效補(bǔ)充非標(biāo)定量和膠分離技術(shù)的缺點(diǎn)。因此，不斷關(guān)注蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的改進(jìn)，有利于更高效準(zhǔn)確的尋找大腸癌證候間的差異蛋白，進(jìn)而為研究證候本質(zhì)提供更多的參考和依據(jù)。

3.3 數(shù)據(jù)的驗(yàn)證及挖掘 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用將大腸癌證候本質(zhì)的研究帶入了前所未有的大數(shù)據(jù)時(shí)代。目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，主要應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合相應(yīng)的軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白進(jìn)行鑒定以及功能檢索。然而，單純對(duì)差異蛋白的鑒定還不能滿足證候本質(zhì)研究的需要。如何對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中大量的差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，以及如何以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步深入探討差異蛋白及其所在通路在大腸癌證候形成中的作用機(jī)制，都將是下一階段應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究大腸癌證候本質(zhì)的核心任務(wù)。

［1］Siegel，R．Cancer statistics，2013［J］．CA Cancer J Clin，2013，63(1):11-30．

［2］吳小秋，劉志龍．中醫(yī)證候的系統(tǒng)生物學(xué)研究［J］．吉林中醫(yī)藥，2013，33(1):12-14．

［3］郭煒，韓濤，董文亮，等．冠心病心絞痛及其中醫(yī)證型的生物學(xué)標(biāo)志研究［J］．吉林中醫(yī)藥，2011，31(10):1030-1032．

［4］朱明丹，杜武勛，姜民，等．冠心病不同證候的蛋白質(zhì)組學(xué)研究［J］．遼寧中醫(yī)雜志，2013，40(7):22-27．

［5］王剛，姜民，朱明丹，等．冠心病心血瘀阻證和心腎陰虛證的蛋白組學(xué)研究［J］．遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(3):26-28．

［6］袁宏偉，杜武勛，朱明丹，等．冠心病心氣虛弱證/心腎陰虛證血清蛋白質(zhì)組學(xué)特征研究［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(4):238-240．

［7］唐春梅，魏嵋．蛋白組學(xué)在肝纖維化及中醫(yī)證候研究中的運(yùn)用［J］．湖南中醫(yī)雜志，2013，29(3):123-124．

［8］孫志嶺，王玲，王富強(qiáng)，等．類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎濕熱痹阻證血清比較蛋白組學(xué)分析［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24(1):237-239．

［9］黃金燕，魏紹斌，文怡，等．運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究子宮內(nèi)膜異位癥中醫(yī)證候的探討［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(1):210-212．

［10］周小軍，周福生，孔梅，等．大腸癌虛實(shí)證候與蛋白質(zhì)差異性表達(dá)的研究［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(8):1808-1811．

［11］周小軍，周懷力，茍新敏，等．大腸癌濕熱蘊(yùn)結(jié)證患者蛋白質(zhì)差異性表達(dá)的研究［J］．中華腫瘤防治雜志，2010，17(22):1831-1834．

［12］周小軍，周福生，茍新敏，等．大腸癌氣血虧虛證患者蛋白質(zhì)差異性表達(dá)的研究［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2010，17(5):274-277．

［13］趙海燕，屠德敬，夏溪，等．6例姑息治療期大腸癌血瘀證血清蛋白質(zhì)組學(xué)探索性研究［J］．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30(8):1777-1779．

［14］徐玉芬，王輝，郭勇，等．圍手術(shù)期大腸癌患者中醫(yī)癥狀特點(diǎn)及證型分布規(guī)律初步分析［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2013，28(3):849-851．

［15］王曉戎，袁孝兵，儲(chǔ)慧琴，等．因子分析和聚類(lèi)分析聯(lián)合應(yīng)用在大腸癌證候分布中的研究［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(5):150-151．

［16］洪朝金，郭勇．表面增強(qiáng)激光解析電離-飛行-質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在大腸癌圍手術(shù)期中醫(yī)證候研究中的應(yīng)用價(jià)值［J］．中醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，27(4):398-399．

［17］覃慧嬋，柳廣南，蘇紅，等．iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)在肺腺癌血漿生物標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用［J］．山東醫(yī)藥，2013，53(20):32-35．