許文歡，阮宏華

(1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇省林業(yè)生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037)

PCR-DGGE應(yīng)用于土壤生態(tài)學(xué)研究的流程及優(yōu)化

許文歡1，阮宏華2*

(1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇省林業(yè)生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，
江蘇 南京 210037)

土壤微生物的多樣性在生態(tài)學(xué)研究中越來越受到關(guān)注。能反映微生物多樣性的技術(shù)有很多，PCR-變性梯度凝膠電泳(Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)技術(shù)是其中的一種。此技術(shù)有其獨(dú)到特色，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。目前關(guān)于該技術(shù)的應(yīng)用已有許多報(bào)道，然而缺少對(duì)該技術(shù)應(yīng)用于土壤生態(tài)學(xué)研究詳細(xì)操作流程的歸納和總結(jié)。操作過程中有許多技術(shù)性問題，包括如何提取和純化土壤DNA、PCR反應(yīng)條件設(shè)置、DGGE電泳條件設(shè)置以及圖譜數(shù)據(jù)分析等。該文簡要?dú)w納了PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于土壤生態(tài)學(xué)研究的流程以及如何優(yōu)化關(guān)鍵性步驟，并提出了有待優(yōu)化的方向。

PCR-DGGE；土壤微生物； 生態(tài)學(xué)； 流程； 優(yōu)化

對(duì)于土壤生態(tài)學(xué)的研究，物質(zhì)循環(huán)和物種多樣性是研究的焦點(diǎn)問題。在土壤中，微生物種類極其豐富，參與了各種元素循環(huán)，僅僅關(guān)注非生物的物質(zhì)循環(huán)或生態(tài)研究已經(jīng)無法滿足要求，因此土壤微生物的研究在土壤生態(tài)學(xué)中越來越受到重視。更多了解土壤微生物群落的分布、遺傳多樣性及其動(dòng)態(tài)特征成了探索土壤微生物的必要途徑。傳統(tǒng)方法如平板分離等，局限性很多，僅有1%的環(huán)境微生物可在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)和分離，而85%～99%細(xì)菌種群不能被分離和認(rèn)識(shí)[1-2]，且無法良好地反映出土壤微生物多樣性的原始特征[3]。

分子生物技術(shù)的發(fā)展，為土壤微生物多樣性方面的研究提供了重要的技術(shù)支撐。分子生物學(xué)的許多方法已應(yīng)用于評(píng)價(jià)土壤微生物群落多樣性的變化[4]，如變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)、限制性酶切片段多態(tài)性分析(RFLP)和末端限制性酶切片段多態(tài)性分析(T-RFLP)等。其中，PCR-DGGE技術(shù)可以更好地解析微生物生態(tài)復(fù)雜性，也可以提供生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性和群落動(dòng)態(tài)性信息。目前關(guān)于該技術(shù)的應(yīng)用已有許多報(bào)道，本文對(duì)PCR-DGGE在土壤微生物生態(tài)學(xué)研究中的流程及優(yōu)化進(jìn)行歸納和分析。

1 PCR-DGGE的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)

1.1 基本原理

PCR-DGGE是1979年由 Fischer等最先提出用于檢測DNA突變的一種電泳技術(shù)，是目前可以探知最完整環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的分子生物技術(shù)。基本原理是不同微生物DNA堿基序列的差異會(huì)導(dǎo)致微生物DNA解鏈程度不一樣，利用這一特性，將得到的DNA樣品在含有線性梯度變性劑的凝膠中進(jìn)行電泳，不同DNA片段在膠體上會(huì)產(chǎn)生許多不同條帶。將條帶進(jìn)行染色后，就能在成像系統(tǒng)中觀察到條帶，每一個(gè)條帶代表一個(gè)特定序列的DNA片段。每個(gè)樣品在各自泳道中形成條帶，在不同泳道中停留在相同位置的條帶，一般可視為具有相同DNA序列，而位置差異越大，條數(shù)越多相對(duì)來說微生物種群越豐富。根據(jù)圖譜和條帶信息，可以得到微生物遺傳多樣性信息，更好地解析微生物的生態(tài)復(fù)雜性。

1.2 優(yōu)缺點(diǎn)

與傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，這項(xiàng)技術(shù)可以分辨只有一個(gè)堿基差異的基因序列[5]。不僅電泳條件很好控制，操作簡便，快速，重復(fù)性好，而且只需1～5ng的DNA或RNA加樣量就可以達(dá)到很清晰的電泳效果。其最大的優(yōu)勢之一是可以同時(shí)分析多個(gè)樣品，可以檢測環(huán)境變化引起的微生物群落變化[6]。Donner等[7]利用該技術(shù)跟蹤了遠(yuǎn)洋動(dòng)態(tài)變化過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和活性的連續(xù)變化。

這項(xiàng)技術(shù)也具有其缺點(diǎn)和局限性，第1，土壤DNA提取過程除雜純化很困難；第2，DGGE技術(shù)一般要求DNA長度在500 bp以下，否則DGGE的分辨率會(huì)下降。但是如果用來判斷微生物所屬的系統(tǒng)類群，16S rDNA片段長度要求至少達(dá)到500 bp[8]。第3，不同DNA序列可能發(fā)生共遷移現(xiàn)象，因此DGGE的條帶數(shù)有可能不能正確反映被分析的混合物中不同序列的數(shù)量，有時(shí)1個(gè)條帶可能代表幾種菌，也可能不同條帶代表1種細(xì)菌。第4，染色后DNA譜帶強(qiáng)度有可能較弱或很不清晰。

2 PCR-DGGE的操作流程及優(yōu)化

PCP-DGGE的基本操作流程包括(1)土壤微生物總DNA的提取和純化；(2)對(duì)提取DNA的一些區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將PCR的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析；(4)對(duì)電泳圖譜照片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.1 土壤DNA的提取和純化優(yōu)化

從土壤中提取和純化DNA是最關(guān)鍵的技術(shù)問題之一，因?yàn)橥寥乐泻泻芏鄰?fù)雜難以去除的成分，如多酚類物質(zhì)等。

土壤中提取微生物總 DNA 可分為2個(gè)步驟: (1) 土壤微生物細(xì)胞裂解和 DNA 提取; ( 2) DNA 純化。粗 DNA 的提取和純化都有許多不同的方法，但往往是純化得到的樣品較少，即便得到純化的樣品，也已經(jīng)流失了大量DNA片段。目前土壤DNA 提取方法，主要可分為3大類，即物理方法、化學(xué)方法、酶裂解法。為了獲得更高純度的DNA，一般會(huì)結(jié)合使用這3種方法[9]。

Purohit等[10]采用pH 9.0的50 mmol/L Tris-HCl對(duì)預(yù)萃取之前的核酸進(jìn)行洗滌，從而提高提取率。此外，加入苯酚或氯仿等措施也能提高DNA提取效率。趙裕棟等[9]通過比較高溫裂解法、SDS-CTAB 原位裂解法和酶裂解法這3種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，同時(shí)參考提取純培養(yǎng)微生物基因組DNA 的方法，提出了優(yōu)化的土壤微生物DNA 提取方案。這種方案主要在以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟進(jìn)行了優(yōu)化處理：(1)增加了預(yù)處理步驟。先過濾，然后在裂解細(xì)胞前，加入DNA 提取液，將樣品放置在37 ℃ 搖床(180 r/min)振蕩30～45 min。可使土壤DNA提取率和提取效果更佳。(2) 采用SDS-溶菌酶法裂解微生物細(xì)胞，并優(yōu)化了裂解時(shí)間和處理時(shí)間。詳細(xì)條件見原文獻(xiàn)。(3) 完成微生物細(xì)胞裂解后，直接加入1 /5 體積的氯仿以除去蛋白質(zhì)，并防止DNA重新吸附在土壤顆粒。(4) 選 擇 20% PEG，2.5 mol/L NaCl 4 ℃ 過夜，來沉淀DNA，以減少 DNA 樣品雜質(zhì)。(5)利用 PVPP 柱純化DNA 粗品。DNA樣品提取后，需要對(duì)提取效率和純度這2個(gè)關(guān)鍵性指標(biāo)進(jìn)行檢測。檢測DNA 樣品純度的指標(biāo)有 A260 /A280，主要用來檢測蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的污染情況，理想比值在1.8～2.0 之間；利用上述方案所得的DNA 純度較高。

騰應(yīng)等[11]在研究農(nóng)田土壤DNA的快速提取中，提出利用FastPrep?核酸快速提取儀和相應(yīng)的Fastprep試劑盒，能夠快速釋放和純化土壤中的DNA。這個(gè)系統(tǒng)在國內(nèi)應(yīng)用的報(bào)道還是鮮有，其不僅具有高效、快速等優(yōu)點(diǎn)，同樣能得到較高純度的土壤DNA[12]。目前，大多研究采用土壤DNA提取專用試劑盒。但是，由于這類專用試劑盒純化強(qiáng)度往往過大，容易導(dǎo)致一些弱勢微生物種群的DNA信息的流失，對(duì)于多樣性研究就失去意義。因此，這方面的優(yōu)化是此技術(shù)的難點(diǎn)。

2.2 PCR擴(kuò)增過程及優(yōu)化

在PCR擴(kuò)增中，選擇合適引物至關(guān)重要。對(duì)于原核微生物的研究一般選擇16S rDNA為擴(kuò)增引物比較合適，Evans 在對(duì)真菌的研究中，則采用18S rRNA。有許多研究表明，18S rRNA更能反映真菌群落特征。選擇16S rDNA有以下幾個(gè)優(yōu)勢：(1)任何一種原核生物體都具有16S rDNA，各物種具有自己的獨(dú)特序列；(2)長度適中，約1 500 個(gè)核苷酸長，適合用作分類學(xué)研究；(3)目前基因資料庫有完備的16S rDNA基因資料[1]。許多研究表明，擴(kuò)增16S rDNA中可變區(qū)V3及V3～V5區(qū)的引物為最佳引物選擇區(qū)。因?yàn)閂3區(qū)PCR-DGGE條帶數(shù)最多，分離效果最好[13]。DGGE檢測的DNA片段最適長度為200～900 bp，對(duì)于200 bp左右的片段(V3區(qū))分離效果最好，但缺乏分類信息；450～500 bp左右片段(V3～V5區(qū)或V6～V8區(qū))的分類信息相對(duì)更豐富[13]，如果要求較高的分類水平，應(yīng)該選擇968f/1401或341/926r作為引物。Chika利用引物968f-GC和1378r擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA，而利用引物NS1和GC擴(kuò)增真菌18S rRNA。值得注意的是，常規(guī)的DGGE電泳技術(shù)對(duì)于長度超過500 bp的DNA片段序列的變化情況，檢出率僅有50%。因此要得到優(yōu)化的電泳圖像，就需要控制DNA片段序列長度在合適的范圍。

目前為了使DGGE檢出率提高到100%，通常在一側(cè)引物的5′端設(shè)計(jì)增加一段富含GC的區(qū)域。這種技術(shù)稱為“GC夾板”，其長度通常為30～50個(gè)核苷酸[13]。研究表明，使用“GC夾板”技術(shù)后，PCR產(chǎn)物在膠板上分離效率大大提高。

如何設(shè)置PCR的反應(yīng)條件參數(shù)也是至關(guān)重要。PCR反應(yīng)一般采用降落PCR策略，其常見的反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55～65 ℃退火30 s或1 min，72 ℃ 2 或3 min延伸，20個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)后復(fù)性溫度降低0.5 ℃。再10個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件同上。最后在72 ℃下延伸7或8 min。根據(jù)Gelsomino等的報(bào)道可對(duì)反應(yīng)體系稍作修改[14]：將啟動(dòng)溫度和時(shí)間改為95 ℃ 15 min(與熱啟動(dòng)酶匹配)。真菌PCR循環(huán)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃ 2 min延伸，35個(gè)循環(huán)，68 ℃延伸保育10 min，后冷卻至4 ℃。

2.3 DGGE分析過程及優(yōu)化

DGGE分析過程的成功與否直接影響微生物的條帶圖譜，因此需要確定最佳電泳溫度和時(shí)間、凝膠濃度和變性劑梯度以及染色劑的選擇。

不同電泳溫度和時(shí)間對(duì)于電泳的效果會(huì)產(chǎn)生很大的差異，最佳解鏈溫度是由平行凝膠電泳試驗(yàn)確定的，而電泳時(shí)間是由DNA的分辨情況來確定[5]。電泳溫度通常要求低于樣品解鏈區(qū)域的Tm(解鏈溫度)值，大多數(shù)DNA片段50～60 ℃比較適合。電泳時(shí)間同樣受凝膠濃度、電泳時(shí)電壓等因素影響，Muyzer等[15]提出，利用時(shí)間進(jìn)程試驗(yàn)，能夠確定最佳電泳時(shí)間(將待測樣品以恒定的時(shí)間間隔在同一塊凝膠上電泳，獲得樣品最大分辨率的時(shí)間)。Kauppi等[16]在D CodeTM系統(tǒng)(Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)中，對(duì)森林土樣微生物DNA擴(kuò)增產(chǎn)物采用80V電壓，電泳16～18 h，得到了較好的效果。

凝膠濃度是根據(jù)基因片段大小確定的，當(dāng)片段在200 bp時(shí)采用8%的凝膠，片段達(dá)到500 bp時(shí)用6%的凝膠 。變性劑濃度梯度可利用垂直變性梯度試驗(yàn)研究DNA片段的解鏈性質(zhì)，從而確定合適的變性劑梯度范圍。對(duì)于16S rDNA V3區(qū)被廣泛使用的變性劑梯度范圍是30%～60%，對(duì)不同土壤類型、不同基因片段，該范圍會(huì)有所差異。 Cycon等[17]在對(duì)土壤細(xì)菌群落進(jìn)行DGGE進(jìn)行分析時(shí)，利用40%～70%梯度范圍，取得了良好的條帶圖紋。而Song等[18]在對(duì)土壤真菌18S rDNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳時(shí)，梯度則采用了25%～45%。

另外，染色方式多種多樣，包括EB，SYBR Green I 和銀染等[19]，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。目前EB染色法成本低，易操作，已成為運(yùn)用最廣泛的方法，其靈敏度可以滿足一般生態(tài)學(xué)研究。而SYBR Green I染色法靈敏高，至少可檢出20 pg DNA，高于EB染色法25～100倍，價(jià)格比銀染便宜。如果需要更高的靈敏度可以使用銀染，其靈敏度比EB高200倍。王靜等[20]運(yùn)用銀染獲得了較好的效果，但是銀染過后的條帶由于DNA不易回收，無法進(jìn)行后續(xù)的雜交分析。

2.4 電泳圖譜照片的數(shù)據(jù)分析及優(yōu)化

目前圖譜數(shù)條帶分析軟件已很多，如Gel-Pro Analyzer，Quantity One和ImageTool等[21]。而近年來Image LabTM軟件得到越來越廣泛的應(yīng)用，此軟件可以運(yùn)行 Gel DocTMEZ 圖像儀以及Gel Doc XR+ 和 ChemiDocTMXRS+ 成像系統(tǒng)，能更優(yōu)化地采集和分析凝膠電泳和印跡膜的數(shù)字圖像和數(shù)據(jù)。流程如下：樣品放好后，自動(dòng)化流程開始采集并優(yōu)化圖像數(shù)據(jù)，然后分析凝膠或印記膜的參數(shù)特征，最終給出詳細(xì)的報(bào)告，這一過程簡便快速只需數(shù)秒鐘，并且Image Lab軟件的應(yīng)用不要求操作人員有任何成像經(jīng)驗(yàn)即可得到優(yōu)化的凝膠和印跡膜圖像。

通過分析軟件，可得到原始DGGE圖譜數(shù)據(jù)。利用原始數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，可采用許多經(jīng)典的多元變量的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。目前最常用的方法是非加權(quán)算術(shù)平均聚類分析法(UPGMA)，可生成直觀的聚類樹。另外，多維尺度分析(Multidimensional scaling，MDS)和主成分分析(Principal component analysis，PCA)也越來越多應(yīng)用于圖譜分析，Araya等[22]采用MDS方法得到了細(xì)菌和真菌的動(dòng)態(tài)變化圖示，很好地反應(yīng)變化規(guī)律。經(jīng)SPASS、SAS等常用的統(tǒng)計(jì)分析軟件可得出Shannon-Weiner多樣性指數(shù)(H’)，均勻度(E)，豐富度(R)和優(yōu)勢度(C)，這些指標(biāo)可以從不同角度反映群落結(jié)構(gòu)特征的量度值。也可利用Matlab(優(yōu)化程序文件獲得途徑http:emuch.net/htm1/201206/4582362.html)進(jìn)行相似度、多樣性指數(shù)以及聚類分析。

3 總結(jié)

盡管PCR-DGGE已經(jīng)是相對(duì)成熟的一種可分析微生物群落的多樣性及動(dòng)態(tài)變化的基因指紋技術(shù)，它在應(yīng)用于土壤生態(tài)學(xué)研究中仍有許多需要優(yōu)化及探索的技術(shù)問題。第1，土壤總DNA快速提取及純度優(yōu)化?？衫梦锢矸椒?、化學(xué)方法、酶裂解法有機(jī)結(jié)合得到優(yōu)化提取方案。第2，PCR反應(yīng)體系及條件優(yōu)化。引物一側(cè)增加“GC夾板”可使分離效率大大提高，根據(jù)Gelsomino的報(bào)道[14]所修改的系數(shù)能得到較優(yōu)化的PCR產(chǎn)物。第3，DGGE過程優(yōu)化。DGGE電泳電壓和時(shí)間，農(nóng)田土壤電泳可采取150V電壓6.5 h；森林土壤可采用80V電壓16～18 h。對(duì)16S rDNA V3區(qū)電泳時(shí)可使用變性劑梯度范圍30%～60%，對(duì)土壤真菌18S rDNA，梯度可采用25%～45%，針對(duì)不同環(huán)境土壤可做調(diào)整。第4，電泳圖條帶分析優(yōu)化。采用Image Lab軟件可快速得到優(yōu)化圖像數(shù)據(jù)以及凝膠或印記膜的參數(shù)特征。在樣品相似度、多樣性指數(shù)或聚類分析時(shí)，可采用Matlab優(yōu)化程序。

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ProceduresandoptimizationofPCR-DGGEapplyingtotheresearchofsoilecology

XU Wen-huan1, RUAN Hong-hua2*

(1.College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;2.Key Laboratory of Forestry Ecological Engineering of Jiangsu Province, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

Soil microbial diversity has

more and more attention in the research of ecology.As one of the techniques which can be applied to present the diversity of microorganism, PCR-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE) has its own feature and has been widely used in various fields.So far, there were so many reports on the use of this technology but few ones on the summary of detailed operation procedures.During the operation procedures, there were some technical problems including how to extract and purify soil DNA, how to set the parameters of the conditions of PCR, how to set the condition of DGGE electrophoresis, how to analyze the atlas and data and so on.The procedures of PCR-DGGE applying to the research of soil ecology, as well as method to optimize critical procedures and the direction of optimization, were reviewed in this paper.

PCR-DGGE; Soil microorganism; Ecology; Procedure; Optimization

1001-7380(2014)04-0046-04

2014-05-09；

2014-05-26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170417)；江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程項(xiàng)目( CXZZ_110510)；江蘇優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)和現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目；江蘇省自然科學(xué)基金青年專項(xiàng)項(xiàng)目(BK20130974)

許文歡(1991-)，男，福建泉州人，在讀碩士，研究方向：土壤生態(tài)學(xué)。

*通信作者：阮宏華(1963-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：森林生態(tài)學(xué)、土壤生態(tài)學(xué)。E-mail: hhruan@njfu.edu.cn。

S154.1

A

10.3969/j.issn.1001-7380.2014.04.012