宣麗楊 金 鑫 孟冠敏

（浙江省立同德醫(yī)院，浙江杭州 310012）

·實驗研究·

水飛薊賓體外對人肝癌細胞株HepG2蛋白表達的影響及臨床意義

宣麗楊 金 鑫 孟冠敏

（浙江省立同德醫(yī)院，浙江杭州 310012）

目的探討水飛薊賓在體外對人肝癌細胞HepG2蛋白表達的影響及臨床意義。方法采用MTT法檢測不同濃度水飛薊賓（Silibinin）對HepG2細胞增殖的影響；采用臺盼藍法檢測不同濃度水飛薊賓對HepG2細胞的殺傷活性；采用western blot免疫印跡法檢測自噬標記蛋白LC3－Ⅱ的表達水平；利用基因沉默技術(shù)，轉(zhuǎn)染BNIP3小RNA（siRNA）抑制BNIP3的表達，之后再用MTT法和Western blot法檢測水飛薊賓對HepG2細胞增殖和自體吞噬的影響。結(jié)果隨著水飛薊賓濃度的提高，水飛薊賓在體外對HepG2細胞的增殖抑制率和殺傷活性逐漸提高；水飛薊賓在體外可顯著誘導(dǎo)HepG2細胞LC3－Ⅱ的表達；水飛薊賓在體外可顯著誘導(dǎo)HepG2細胞BNIP3的表達；轉(zhuǎn)染BNIP3 siRNA后，水飛薊賓對HepG2細胞的增殖抑制率25.3± 4.0和LC3－Ⅱ表達水平0.35±0.11相比于對照組的增殖抑制率63.1±7.0和LC3－Ⅱ表達水平0.70±0.19顯著下降。結(jié)論水飛薊賓通過上調(diào)BNIP3的表達誘導(dǎo)人肝癌細胞發(fā)生自噬性死亡。

水飛薊賓；HepG2；自體吞噬；BNIP3

水飛薊賓是從水飛薊屬植物奶薊種子中提取的一種黃酮類化合物，臨床上主要用來保護肝細胞，對黃疸、肝炎、膽囊疾病有良好的療效［1］。近年來，水飛薊賓還被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性，對于多種腫瘤均具有良好的抑制作用［2－3］，然而對肝腫瘤的抑制作用卻很少報道，而且抗腫瘤作用的機制也不十分清楚，作者通過體外實驗發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可以誘導(dǎo)肝腫瘤細胞發(fā)生自噬性死亡，報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 本研究于2013年5月～2014年3月本院檢驗中心完成。人肝癌細胞株HepG2（A TCC，美國模式培養(yǎng)物保藏所，HB－8065），RPIM－1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，11875－085），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程有限公司，HB0205），水飛薊賓（Silibinin，美國Sigma公司，S0417），臺盼藍（美國Sigma公司，302643），噻唑藍（MTT，美國Sigma公司，M2128），3－甲基腺嘌呤（3－MA，美國Sigma公司，M9281），細胞裂解液（美國cell signaling公司，＃9803），LC3－Ⅱ多克隆抗體（美國cell signaling公司，＃2775），β－actin單抗（美國cell signaling公司，＃4967），BNIP3多克隆抗體（美國cell signaling公司，＃3769），PVDF膜（美國Millipore公司，IPVH00010），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司，11668030），BNIP3 siRNA及無關(guān)對照siRNA由上海吉瑪公司合成，BNIP3的siRNA序列為：正向：5′－CACGAGCGUCAUGAAGAAAUU－3′，反向：5′－UUUCUUCAUGACGCUCGUGUU－3′。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株HepG2培養(yǎng)在含10%FBS的RPIM－1640培養(yǎng)基中，置于37℃含5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，實驗選用對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 MTT試驗 將HepG2細胞按1000／孔接種于96孔板，設(shè)置3個復(fù)孔，加入200μL含10%FBS的RPIM－1640培養(yǎng)基并分別加入0、10、50、100μmol／L的silibinin于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24小時，另設(shè)一組加入3mmol／L的3－MA培養(yǎng)2小時，然后再加入100μmol／L的Silibinin培養(yǎng)24小時之后加5g／L MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。棄上清液，往孔中加150μL二甲亞砜（DMSO），震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570nm波長下用酶標儀檢測OD值，結(jié)果以3次實驗的平均值表示。細胞生長的抑制率以以下公式計算：抑制率＝1－實驗組平均OD值／對照組平均OD值。

1.2.3 臺盼藍染色法檢測HepG2細胞死亡率 將HepG2細胞按兩組培養(yǎng)，一組為用含10%FBS的RPIM－1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，另一組為用不含F(xiàn)BS的RPIM－1640饑餓培養(yǎng)（serum starved，SS）24小時。兩組都取5000／孔接種于96孔板，兩組分別加入0μmol／L或100μmol／L的Silibinin培養(yǎng)2、6、12、24小時，之后用臺盼藍對細胞進行染色，死亡細胞被染成藍色，活細胞不著色，腫瘤細胞的死亡率＝染色細胞數(shù)／總細胞數(shù)。

1.2.4 Western blot法檢測LC3－II和BNIP3蛋白表達水平 在HepG2細胞培養(yǎng)瓶中分別加入0μmol／L，10μmol／L，50μmol／L，100μmol／L的Silibinin培養(yǎng)24小時，同時另設(shè)一組在培養(yǎng)瓶中先加入3mmol／L的3－MA培養(yǎng)2小時，然后再加入100μmol／L的Silibinin培養(yǎng)24小時，然后取細胞裂解液做Western blot實驗，檢測LC3－II和BNIP3的表達，蛋白表達量由膠片上的灰度值表示，灰度值計算使用ImageJ軟件分析，目標蛋白相對表達量＝目標蛋白灰度值／β－actin灰度值。

1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染 按照Lipofectamine 2000操作說明書在HepG2培養(yǎng)體系中分別加入100nmol／L的BNIP3 siRNA以及無關(guān)對照siRNA培養(yǎng)16小時，之后加100μmol／L的Silibinin再培養(yǎng)24小時，檢測細胞的增殖和自噬程度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，采用非配對雙向t檢驗以及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 水飛薊賓對人肝癌細胞HepG2的抑制作用將HepG2細胞在不同劑量Silibinin下治療24小時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各劑量組相比于未加Silibinin的對照組均呈現(xiàn)出抑制效應(yīng)，且呈劑量依賴性，而HepG2細胞用自噬抑制劑3－MA預(yù)處理后，再加Silibinin培養(yǎng)，Silibinin對HepG2細胞的抑制作用相比于未用3－MA預(yù)處理組明顯減弱，提示水飛薊賓通過誘導(dǎo)腫瘤細胞過度的自體吞噬效應(yīng)殺傷腫瘤細胞，見表1。在血清饑餓的環(huán)境下，水飛薊賓（100μmol／L）在治療HepG2細胞6小時后，HepG2細胞的死亡率為（48.5± 4.5）%，而在血清充足環(huán)境下，水飛薊賓（100μmol／L）在治療HepG2細胞6小時后，HepG2細胞的死亡率為（5.2±1.6）%，提示血清饑餓可增強HepG2對水飛薊賓殺傷活性的敏感性，詳見表2。

表1 不同劑量水飛薊賓對HepG2細胞增殖抑制率的比較（±s）

表1 不同劑量水飛薊賓對HepG2細胞增殖抑制率的比較（±s）

與對照組比較*P＜0.05，與10μmol／L Silibinin組比較＃P＜0.05，與50μmol／L Silibinin組比較☆P＜0.05，與100μmol／L Silibinin組比較△P＜0.05

組 別n／孔抑制率*△（%）對 照 組30 10μmol／L Silibinin組36.3±1.9*50μmol／L Silibinin組342.1±4.8*＃100μmol／L Silibinin組362.3±6.4*☆100μmol／L Silibinin＋3－MA組327.3±4.0

表2 血清缺乏或充足時水飛薊賓對HepG2細胞死亡率的比較（±s ，%）

表2 血清缺乏或充足時水飛薊賓對HepG2細胞死亡率的比較（±s ，%）

與對照組比較*P＜0.05，與Silibinin組比較△P＜0.05

小時對照組31.3±0.21.2±0.21.5±0.32.1±0.4 SS組31.1±0.31.9±0.42.7±0.63.8±0.8 Silibinin組31.8±0.45.2±1.6*23.6±4.1*64.2±6.1*SS＋Silibinin組313.2±2.5*△48.5±4.5*△63.3±7.2*△70.4±6.6組 別n／孔2小時6小時12小時24 *△

2.2 水飛薊賓誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生自體吞噬HepG2細胞在不同濃度Silibinin的作用下相比于未加Silibinin的對照組LC3－Ⅱ和BNIP3的表達均明顯升高，而HepG2細胞用3－MA預(yù)處理后再加Silibinin培養(yǎng)，LC3－Ⅱ的表達相比于未加3－MA組顯著減少（P＜0.05），而BNIP3的表達則不受影響（P＞0.05）。這些結(jié)果進一步說明了水飛薊賓能誘導(dǎo)人肝癌細胞發(fā)生自體吞噬且上調(diào)BNIP3的表達，詳見表3、圖1。

表3 不同劑量水飛薊賓對HepG2細胞LC3－Ⅱ和BNIP3蛋白表達的比較（±s）

表3 不同劑量水飛薊賓對HepG2細胞LC3－Ⅱ和BNIP3蛋白表達的比較（±s）

與對照組比較*P＜0.05，與10μmol／L Silibinin組比較＃P＜0.05，與50μmol／L Silibinin組比較☆P＜0.05，與100μmol／L Silibinin組比較△P＜0.05

組 別n／孔LC3－Ⅱ／β－actin BNIP3／β－actin對 照 組30.01±0.010.24±0.08 10μmol／L Silibinin組30.11±0.05*0.31±0.13*50μmol／L Silibinin組30.42±0.16*＃0.72±0.20*＃100μmol／L Silibinin組30.73±0.21*☆0.88±0.25*☆100μmol／L Silibinin＋3－MA組30.29±0.10*△0.83±0.26*

圖1 不同劑量水飛薊賓對HepG2細胞LC3－Ⅱ和BNIP3蛋白表達的比較。

2.3 BNIP3的表達對水飛薊賓發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響 先將HepG2細胞轉(zhuǎn)染100 nmol／L對照siRNA或100 nmol／L BNIP3 siRNA培養(yǎng)12小時，再分別加入100μmol／L水飛薊賓培養(yǎng)24小時，用MTT法檢測這兩組的增殖抑制率和LC3－II及BNIP3的蛋白表達。結(jié)果如表4所示，BNIP3 siRNA組與對照siRNA的相比，水飛薊賓對HepG2細胞的增殖抑制率明顯降低（P＜0.05），同時水飛薊賓對自噬標記蛋白LC3－Ⅱ的誘導(dǎo)作用也明顯降低（P＜0.05）。表3、表4結(jié)果提示水飛薊賓誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生自體吞噬而導(dǎo)致腫瘤細胞死亡的機制依賴于BNIP3表達水平的上調(diào)。

表4 BNIP3 siRNA對水飛薊賓發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

表4 BNIP3 siRNA對水飛薊賓發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

與對照siRNA組比較*P＜0.05

組 別n／孔BNIP3／β－actin LC3－Ⅱ／β－actin增殖抑制率（%）對照siRNA組30.84±0.250.70±0.1963.1±7.0 BNIP3siRNA組30.28±0.05*0.35±0.11*25.3±4.0*

3 討 論

自體吞噬過程是一個吞噬自身細胞質(zhì)蛋白并使其包被進入囊泡的過程，是正常細胞都會發(fā)生的一個過程，當(dāng)細胞處于營養(yǎng)缺乏的“饑餓”狀態(tài)時，細胞會加強自身的自體吞噬來分解一部分細胞蛋白，這一過程受許多自噬相關(guān)基因的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)很多促自噬因子都能抑制癌癥發(fā)生，腫瘤細胞過度的自噬會導(dǎo)致腫瘤細胞死亡［4］。本研究通過3－MA抑制了水飛薊賓引起的HepG2細胞的自噬及殺傷活性，證實了水飛薊賓能通過誘導(dǎo)人肝癌細胞發(fā)生高度自噬并誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生自噬性死亡。同時還發(fā)現(xiàn)當(dāng)HepG2細胞處于營養(yǎng)缺乏的“饑餓”狀態(tài)時，其對水飛薊賓的敏感性大大增強，水飛薊賓在短時間內(nèi)就能形成對肝腫瘤細胞的殺傷，這可能是因為當(dāng)腫瘤細胞處于“饑餓”狀態(tài)時，其自身生理的自噬程度相對提高，且分解了一些自噬抵抗蛋白［5］，從而對促自噬信號格外敏感。

BNIP3是Bcl－2家族成員中包含單BH3區(qū)的促凋亡成員，屬于BH3－only亞家族，研究表明BNIP3在細胞死亡的傳導(dǎo)途徑中有十分重要的作用，它的高度表達能誘導(dǎo)非凋亡性的程序性死亡即自噬性死亡［6］。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)水飛薊賓能顯著上調(diào)HepG2細胞BNIP3的表達，而當(dāng)用BNIP3特異性siRNA干擾BNIP3的上調(diào)時，水飛薊賓對HepG2細胞自噬的誘導(dǎo)效應(yīng)和殺傷活性顯著下降，表明水飛薊賓誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生自體吞噬而導(dǎo)致腫瘤細胞死亡的機制依賴于BNIP3表達水平的上調(diào)。

［1］Milic′N，Milosevic′N，Abenavoli L，et al．New therapeutic potentials of milk thistle（Silybum marianum）．Nat Prod Commun，2013，8（12）：1801

［2］Akhtar R，Ali M，Mahmood S，Sanyal S N．Anti－proliferative action of silibinin on human colon adenomatous．cancer HT－29 cells．Nutr Hosp，2014，29（2）：388

［3］Oh S J，Jung S P，Kim J H，et al．Silibinin inhibits TPA－induced cell migration and MMP－9 expression in thyroid and breast cancer cells．Oncol Rep，2013，29（4）：1343

［4］Barth J M，K?hler K．How to Take Autophagy and Endocytosis Up a Notch．Biomed Res Int，2014，2014：960803

［5］Green D R，Levine B．To Be or Not to Be？How Selective Autophagy and Cell Death Govern Cell Fate．Cell，2014，157（1）：65

［6］Gustafsson A B．Bnip3 as a dual regulator of mitochondrial turnover and cell death in the myocardium．Pediatr Cardiol，2011，32（3）：267