浙江師范大學(xué)生化學(xué)院 張曉 楊洋 孫梅好

一種基于酵母3’，5’-二磷酸核苷酸酶的蛋白親和層析純化體系

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的研究在后基因組時(shí)代尤為重要。為深入分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，

研究者們需要分離純化大量不同的蛋白質(zhì)。親和層析具有高選擇性、高活性回收率和高純度等特點(diǎn)已成為純化蛋白質(zhì)等生物大分子最有效的技術(shù)之一。目前，常用的親和層析標(biāo)簽有多聚組氨酸、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶、麥芽糖結(jié)合蛋白等，但不同的標(biāo)簽各有其優(yōu)缺點(diǎn)。例如：研究發(fā)現(xiàn)如果表達(dá)的蛋白表面有幾個(gè)接近的組氨酸，此蛋白可能結(jié)合Ni-NTA介質(zhì)，最終和目的蛋白一同洗脫下來(lái)，導(dǎo)致多聚組氨酸標(biāo)簽純化的蛋白純度不夠；麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽的缺點(diǎn)為層析介質(zhì)價(jià)格較高且純化的目的蛋白純度較低；谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶標(biāo)簽的缺點(diǎn)為標(biāo)簽蛋白中半胱氨酸的氧化可導(dǎo)致目的蛋白凝集，且此蛋白與其配體的結(jié)合較慢，因此，我們需要降低上樣流速，延長(zhǎng)樣品的上樣時(shí)間等。最近，我們開發(fā)了以酵母

3’，5’-二磷酸核苷酸酶作為原核蛋白表達(dá)和分離純化的標(biāo)簽。本文主要對(duì)其蛋白純化原理和方法進(jìn)行總結(jié)。

一、3’，5’-二磷酸核苷酸酶

3’，5’二磷酸核苷酸酶水解3’，5’二磷酸腺苷或者3’-磷酸腺苷5’-磷酰硫酸的3’磷酸基團(tuán)，分別產(chǎn)生5’-單磷酸腺苷和腺苷5’-磷酰硫酸。此酶可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)PAP的濃度，從而調(diào)節(jié)硫酸轉(zhuǎn)移酶、?；D(zhuǎn)移酶、RNA處理相關(guān)酶的活性，參與細(xì)胞的硫代謝和耐鹽性。來(lái)自酵母的3’，5’二磷酸核苷酸酶也稱為HAL2，屬于鎂離子依賴、鋰離子敏感的磷酸單酯酶超家族，可提高酵母的耐鹽性。HAL2和PAP具有較高的親和力，且市場(chǎng)上可買到PAP瓊脂糖，使得研究者可利用PAP瓊脂糖從酵母和豬肝臟中純化

3’，5’二磷酸核苷酸酶，且分析表明KmPAP大約為0.7～17.0M。因此，3’，5’二磷酸核苷酸酶可以開發(fā)為蛋白純化的親和標(biāo)簽。

二、HAL2特性分析

為深入分析HAL2是否可用來(lái)作為蛋白純化的標(biāo)簽，我們從酵母基因組中克隆HAL2基因，參照發(fā)表文獻(xiàn)方法進(jìn)行了蛋白純化。動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明KmPAP和KcatPAP分別為0.25(±0.02)μM和10.8(±0.3)s-1。鈣離子作為鎂離子的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，1mM鈣離子可完全抑制HAL2對(duì)PAP的水解活性。我們利用熒光標(biāo)記的PAP類似物，進(jìn)行解離常數(shù)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在pH8.0的條件下，其Kd為8 nM，且利用EGTA螯合鈣離子可有效解離HAL2·PAP復(fù)合體。另外，我們利用熒光標(biāo)記PAP類似物（mPAP)，進(jìn)行mPAP與HAL2的結(jié)合測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在pH6.0，7.0，7.5，8.0和9.0條件下，其Kd分別是433(±139)nM，68.0(13.0)nM，7.6(±2.5)nM，8.5(±1.6)nM和50.9(±7.0)nM。在pH7.5和8時(shí)，其親和能力最強(qiáng)，其Kd約為8nM。

三、親和層析步驟的合理設(shè)計(jì)

根據(jù)相關(guān)結(jié)果，為更經(jīng)濟(jì)、有效地純化HAL2標(biāo)簽蛋白，我們認(rèn)為應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

1.溶液pH：經(jīng)研究，我們所選用溶液的pH7.5-8.0。

2.胞內(nèi)廣泛存在的磷酸酶：純化體系的溶液中加入EDTA(10 mM)螯合鎂離子以消除磷酸酶活性。

3.鈣離子的應(yīng)用：鈣離子可以促進(jìn)HAL2與PAP的結(jié)合，應(yīng)用EGTA螯合鈣離子進(jìn)行蛋白的洗脫。

四、載體的構(gòu)建

為了更有效的利用HAL2作為蛋白純化標(biāo)簽，我們將3’端有人鼻病毒3C蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)編碼序列（R3CR）的HAL2連接入pET24a（NdeI和HindIII），構(gòu)建pHAL載體。為驗(yàn)證此載體是否有效可行，我們克隆了大腸桿菌APS激酶（APSkinase，APSK）基因，并利用HindIII和XhoI酶切位點(diǎn)插入pHAL，構(gòu)建HAL-APSK融合蛋白表達(dá)載體（pHAL-APSK）。PCR擴(kuò)增無(wú)R3CR序列的HAL2，并連接入pET24a（NdeI和HindIII），然后利用HindIII和XhoI位點(diǎn)插入人鼻病毒3C蛋白酶基因（R3C），構(gòu)建HAL3C蛋白酶表達(dá)載體（pHAL3C）。

五、蛋白表達(dá)純化

轉(zhuǎn)化表達(dá)載體至表達(dá)菌株BL21（DE3），利用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600=0.5左右，加入0.5mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，于16℃誘導(dǎo)表達(dá)16hr后，離心收集菌體。利用裂解液懸浮菌體，經(jīng)4℃溫浴1h后，超聲波破碎細(xì)胞。離心取上清液，上樣至經(jīng)裂解液平衡的PAP瓊脂糖凝膠柱；上樣結(jié)束后，用10倍體積的裂解液洗滌層析柱；然后，用10倍體積的高鹽洗滌液洗滌；再利用10倍洗滌液洗滌層析柱；最后利用洗脫液洗脫獲得融合蛋白HAL-APSK和HAL3C。HAL3C蛋白經(jīng)濃縮定量后，于-80℃冰箱保存?zhèn)?/p>