張偉張雪玲朱雪王國梁孟蕓張莉張曉蕾

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250011）

清金益肺湯對痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠病理及免疫功能的影響

張偉1張雪玲2朱雪1王國梁2孟蕓2張莉2張曉蕾2

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250011）

目的：通過檢測痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠應(yīng)用清金益肺湯后肺組織IL-8、TGF-β1的表達(dá)水平及光鏡下的病理變化，探討清金益肺湯對痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠病理及免疫功能的影響。方法：清潔級健康雄性SD大鼠40只，隨機分為5組：空白對照組、痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化模型組（模型組）、中藥治療組（中藥組）、激素治療組（激素組）、中藥加激素治療組（綜合治療組）。采用氣管內(nèi)滴入博來霉素的方法建立肺纖維化模型。造模結(jié)束后第2天氣管內(nèi)滴加脂多糖建立痰熱蘊肺證模型。ELISA法檢測各組大鼠肺組織IL-8、TGF-β1的表達(dá)水平，光鏡下觀察各組大鼠肺組織的病理改變。結(jié)果：模型組、中藥組、激素組、綜合治療組大鼠肺組織在光鏡下均有肺纖維化的特征性病理改變，但程度有所不同。與空白對照組相比，其余各組大鼠IL-8及TGF-β1的表達(dá)水平均明顯增高；模型組表達(dá)水平明顯高于中藥組、激素組和綜合治療組；綜合治療組明顯低于中藥組和激素組；中藥組和激素組IL-8的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；激素組TGF-β1水平明顯高于中藥組。結(jié)論：清金益肺湯可改善痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠的呼吸功能、結(jié)構(gòu)改變，并能調(diào)節(jié)免疫，與激素聯(lián)合可增強抗纖維化力度。

特發(fā)性肺纖維化 痰熱蘊肺 清金益肺湯 IL-8 TGF-β1 病理學(xué) 實驗研究

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）是一組主要累及肺間質(zhì)、肺泡和（或）細(xì)支氣管的肺部彌漫性疾病，主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性勞力氣促、限制性通氣功能障礙伴彌散功能降低、低氧血癥和影像學(xué)上的雙肺彌漫性病變，其后期多因并發(fā)呼吸衰竭而死亡[1]。本病病因未明，發(fā)病機制亦未完全明確，但已有足夠證據(jù)表明與免疫炎癥損傷有關(guān)。清金益肺湯是在清金化痰湯的基礎(chǔ)上，根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論而確立的有確切臨床療效的方劑，功在清熱化痰、肅肺祛瘀。本實驗擬通過檢測痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠應(yīng)用清金益肺湯后肺組織IL-8、TGF-β1的表達(dá)水平及光鏡下的病理變化，以期探討清金益肺湯對痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化大鼠病理及免疫功能的影響，為臨床提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級健康雄性SD大鼠40只，鼠齡10～12周，體重（200±20）g。動物來自山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（魯）20110003。

1.2 實驗試劑和藥物博來霉素（BLM），invitrogen公司，批號：1134142；脂多糖（LPS），美國Sigma公司；10%水合氯醛，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，批號：20130305；PBS緩沖液（pH=7.4）；清金益肺湯（藥物組成：炙麻黃9g，炒白果12g，炒杏仁12g，桔梗12g，川貝12g，浙貝12g，黃芩12g，川芎12g，梔子12g，桑白皮12g，知母12g，瓜蔞30g，金銀花30g，清半夏9g，丹參18g，蒲公英30g，蜈蚣2條，生甘草6g），煎液由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制備；潑尼松片，天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司，批號：20130123。

1.3主要儀器和設(shè)備AE200電子分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；微量高速離心機（國產(chǎn)），型號：TG16W；Labsystems Multiskan MS酶標(biāo)儀（芬蘭），型號：352；Thermo Labsystems洗板機（芬蘭），型號：AC8；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（國產(chǎn)），型號：GNP-9080；病理圖像分析（CX41-32rfl，OLYMPUS）；美國GATAN CCD圖像處理系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1 分組與造模大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，采用隨機數(shù)字表法分為5組：空白對照組（空白組）、痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化模型組（模型組）、中藥治療組（中藥組）、激素治療組（激素組）、中藥加激素治療組（綜合治療組）。除空白組外，其余各組大鼠參照Szapiel[2]的方法造模。試驗第1天，在室溫環(huán)境下，將大鼠逐一稱質(zhì)量，按0.4mL/100g體質(zhì)量腹腔注射濃度為10%水合氯醛溶液，待大鼠麻醉后，將其固定于解剖臺上，頭低位暴露聲門，將16號靜脈套管針沿氣管走行快速插入氣管，拔出針芯，接1mL注射器，1s內(nèi)注入博萊霉素A5藥液（5mg/kg），左右旋轉(zhuǎn)鼠板，使博萊霉素A5藥液均勻分布于兩肺，制成肺纖維化模型。試驗第3天將大鼠麻醉，暴露氣管，一次性注入溶于注射用生理鹽水的濃度為1g/L的脂多糖0.2mL/200g，將大鼠直立，左右旋轉(zhuǎn)，使脂多糖在肺內(nèi)均勻分布，造成痰熱蘊肺證模型。[3-4]

2.2 給藥方法造模完成后，于實驗第5天開始，中藥組大鼠給予中藥煎液10mL/kg灌胃，激素組大鼠用強的松（3mg/kg）和生理鹽水的混合制劑10mL/kg灌胃，綜合治療組大鼠用中藥煎劑10m L/kg加強的松10mL/kg灌胃，頻次均為每天1次，灌胃14d?？瞻?、模型組正常飲食，不予特殊處理。各組動物分別于實驗第19天處死。大鼠藥物用量根據(jù)公式計算，人服用藥物總量為N，人體重量按70kg算，大鼠重量為m，則大鼠所需藥量n=N/70×m×6[5]。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 動物一般情況監(jiān)測每天觀察大鼠的活動度、對外界反應(yīng)的靈敏度、皮毛光澤、口唇鼻毛色澤、體重、飲食、呼吸、死亡等情況。

2.3.2 ELISA法檢測肺組織IL-8、TGF-β1的表達(dá)水平大鼠麻醉后取出右肺上葉組織200～500mg，制備成10%的勻漿，離心取上清，ELISA法檢測IL-8、TGF-β1的含量。

2.3.3 光鏡下肺組織病理觀察各組大鼠用10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉后，取新鮮左肺下葉組織經(jīng)10%中性福爾馬林48h充分固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)4μm切片4張，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般情況空白組大鼠毛發(fā)亮白，有光澤，反應(yīng)靈敏，呼吸平穩(wěn)，體重逐日增加，無特殊不良表現(xiàn)。造模后各組大鼠出現(xiàn)不同程度的毛發(fā)發(fā)黃、凌亂、脫落、缺少光澤，舌質(zhì)暗紅，呼吸喘促，食量減少，體重增幅減輕。中藥組、激素組、綜合治療組大鼠在毛發(fā)、靈敏度等方面均較模型組表現(xiàn)良好，尤以綜合治療組為優(yōu)。治療結(jié)束后，中藥組、激素組、綜合治療組大鼠靈敏度、毛發(fā)光澤度、舌色、呼吸等均較用藥前有明顯改善。

3.2 各組大鼠肺組織IL-8及TGF-β1表達(dá)水平見表1。

表1 各組大鼠肺組織IL-8及TGF-β1的表達(dá)水平（±s）ng/L

表1 各組大鼠肺組織IL-8及TGF-β1的表達(dá)水平（±s）ng/L

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與綜合治療組比較，△△P＜0.01；與中藥組比較，▲P＜0.05。

組別動物數(shù)IL-8空白組TGF-β1 8 386.62±7.54143.19±3.05 8 516.58±16.5**綜合治療組8 427.72±8.26**##155.41±4.61**##中藥組8 485.49±16.1**##△△183.28±2.42**##△△激素組8 498.29±8.34**##△△167.77±5.55**##△△▲模型組195.24±5.48**

3.3 光鏡下各組大鼠肺組織病理改變見圖1?？瞻捉M雙肺呈粉紅色，表面光滑，彈性良好；各造模組可見不同程度的點狀出血、灶狀瘀斑，肺臟表面蒼白，體積縮小，硬度增加，表面呈結(jié)節(jié)樣改變?？瞻捉M（圖1-K①、K②）：肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔未見增厚，無水腫、炎癥及纖維化表現(xiàn)，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出；模型組（圖1-M①、M②）肺毛細(xì)血管明顯充血、出血，肺泡間隔明顯增寬變形，肺泡壁增厚水腫，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維細(xì)胞和膠原纖維顯著增生；綜合治療組（圖1-H①、H②）支氣管、肺泡間隔輕度水腫，肺毛細(xì)血管無明顯充血、出血，無明顯炎性細(xì)胞滲出；中藥組（圖1-Z①、Z②）肺毛細(xì)血管輕度充血、出血，肺泡壁水腫，肺泡結(jié)構(gòu)接近正常，輕度炎性細(xì)胞浸潤；激素組（圖1-J①、J②）支氣管、肺泡壁中度水腫，有炎性細(xì)胞浸潤表現(xiàn)，肺毛細(xì)血管可見輕度充血、出血，成纖維細(xì)胞增多。

4 討論

本研究所采用的肺纖維化造模方法源于Szapiel等[2]的方法，痰熱蘊肺證病理模型的建立采用氣管內(nèi)滴入脂多糖的方法，我們過往的研究表明，采用這種方法處理后的模型大鼠，其臨床表現(xiàn)、病理及病理生理改變與人類肺部炎癥病變非常相似[3-4]。我們通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，在給藥后第3天大鼠肺組織纖維化程度最為明顯，而前期動物實驗證實脂多糖給藥后第2天出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)[3]。我們此次實驗中光鏡下病理結(jié)果均符合人類特發(fā)性肺纖維化的病理表現(xiàn)，同時又有炎癥存在，說明痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化模型復(fù)制成功。

目前認(rèn)為，肺纖維化的發(fā)病最初就有成纖維灶的形成，伴或不伴間質(zhì)性炎癥，最終形成肺纖維化[6-7]。且血管的生成在肺纖維化發(fā)生早期可能起重要作用，調(diào)節(jié)過度的血管生成有可能延緩肺纖維化的發(fā)展進(jìn)程[8]。

IL-8是一種由肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物活性的細(xì)胞因子。研究表明，IL-8在肺纖維化患者肺組織中中性粒細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞狙擊、介質(zhì)釋放等炎癥過程中起關(guān)鍵作用，可作為判斷肺纖維化炎癥程度的指標(biāo)之一[9]。我們認(rèn)為，特發(fā)性肺纖維化痰熱蘊肺型主要表現(xiàn)為炎癥的改變。本實驗中，與空白組比較，模型組IL-8有顯著升高，經(jīng)治療后各組IL-8均明顯降低，以綜合治療組降低最為明顯，中藥組、激素組次之且組間無明顯差異，提示了不管是中藥清金益肺湯還是激素強的松均抑制了肺組織IL-8的表達(dá)，減輕了炎癥反應(yīng)，激活和調(diào)節(jié)了免疫細(xì)胞，尤以中藥與激素聯(lián)用的效果最著。雖然中藥組和激素組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是光鏡下我們發(fā)現(xiàn)，中藥組大鼠不管是在炎癥浸潤、肺毛細(xì)血管充血還是成纖維細(xì)胞形成方面，都較激素組表現(xiàn)良好，這就說明與強的松相比，清金益肺湯在改善氣道功能、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面有其獨特的優(yōu)勢。同時我們可以看到，單純的中藥或激素雖然對肺纖維化的治療有一定作用，但二者協(xié)同聯(lián)用效果會更好。

圖1 各組大鼠肺組織病理圖片（×10）

TGF-β1具有多重的生物學(xué)作用。研究表明，TGF-β1是一種促血管生成因子，可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的成活及VEGF的表達(dá)而促進(jìn)新生血管的生成[10-11]，最終導(dǎo)致纖維化。本實驗中，模型組大鼠肺組織TGF-β1的表達(dá)水平與空白組比較明顯升高，表明模型組的肺損害明顯；治療后以綜合治療組肺組織TGF-β1表達(dá)最低，這彰顯了清金益肺湯和激素聯(lián)用的優(yōu)越性；中藥組肺組織TGF-β1表達(dá)低于激素組，且光鏡下中藥組的肺損傷明顯低于激素組，表明清金益肺湯可能通過抑制TGF-β1的表達(dá)而調(diào)控了細(xì)胞反應(yīng)，調(diào)節(jié)了大鼠的免疫功能，減輕了大鼠的肺纖維化。

目前，特發(fā)性肺纖維化的西醫(yī)治療多采用糖皮質(zhì)激素聯(lián)合細(xì)胞毒藥物。近年來，中醫(yī)界關(guān)于肺纖維化的病機存在諸多爭論，但越來越多的學(xué)者提出血瘀內(nèi)阻貫穿本病始終[12-14]。清金益肺湯是由《醫(yī)學(xué)統(tǒng)旨》中所載的清金化痰湯化裁而來。方中蜜麻黃、炒杏仁、炒白果宣肅肺氣，提壺揭蓋；川貝、浙貝、桑白皮之類肅肺清熱，化痰平喘；因該病多見瘀血表現(xiàn)，方中加入川芎、丹參之類活血祛瘀；蜈蚣一味更妙，可加強逐瘀之力。本方是經(jīng)臨床和實驗驗證的對痰熱蘊肺型特發(fā)性肺纖維化行之有效的方劑。痰熱蘊肺是肺纖維化的常見證型，在辨證施治中，當(dāng)注重清熱化痰藥與活血祛瘀藥配伍，并聯(lián)用西藥糖皮質(zhì)激素，勢必會收到事半功倍之效。

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R563.905

A

1672-397X（2014）07-0074-03

張偉（1963-），男，博士，中醫(yī)肺病學(xué)泰山學(xué)者崗位特聘專家，二級教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合呼吸系統(tǒng)疾病的臨床診療及基礎(chǔ)研究。

張雪玲，zxl89124@126.com

2013-12-24

編輯：吳寧

泰山學(xué)者建設(shè)工程專項經(jīng)費資助項目（ts20110819）；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃（2011-050）