李娟莉 陸奕宇 蘇式兵

心肌缺血常見于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，是由于心臟冠狀動脈循環(huán)改變引起冠狀血流和心肌需求之間不平衡而導致的心肌損害。心肌缺血嚴重者可導致缺血局部的心肌梗死，甚至引起猝死。目前，臨床上尚缺乏能夠有效改善心肌缺血、預防心肌梗死，且安全的藥物。中藥復方碧血膠囊具有改善實驗大鼠心功能和血流動力學［1］和血液流變性［2］以及降低血脂的作用［3］。本研究采用大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)模型，通過測定用藥前后大鼠模型心電圖、心梗面積以及血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的變化，進一步觀察了碧血膠囊對結扎大鼠冠狀動脈造成心肌梗死的保護作用，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

選用7 周齡的健康清潔級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，實驗動物由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，2010年5月購入(動物許可號SCXK2007-0005)。

1.2 分組及給藥

將SD 大鼠隨機分為6 組，每組10 只，分別為:假手術組、急性心肌梗塞模型(AMI)組、碧血膠囊(原料藥的重量配比為:三七總皂苷5 份，絞股藍總皂苷5 份，竹葉提取物4 份，水蛭細粉20 份)高劑量組(968 mg/kg)和低劑量組(484 mg/kg)，通心絡膠囊組(500 mg/kg)，地爾硫卓靜脈滴注組［4.5 mg/(200 g·d)，30～40 分鐘內(nèi)滴完］。由于在手術中出現(xiàn)結扎所致的出血、心律失常等，導致大鼠的死亡，各組大鼠最終的統(tǒng)計分析動物數(shù)均為8 只。

1.3 實驗性AMI 大鼠模型的制備

按照文獻進行模型制備［4］。實驗大鼠各給藥組按照上述劑量每天1 次，灌胃1 周，各組最后統(tǒng)計分析的動物數(shù)均為8 只。在各灌胃組末次給藥后2小時后手術，地爾硫卓組在急性手術前10 分鐘尾靜脈注入。除假手術組開胸過線但不結扎外，其余動物行開胸手術建立AMI 模型。具體方法是以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，大鼠背位固定，連接記錄心電圖的記錄電極，頸部皮膚切開氣管，連接C201 型動物呼吸機。同時進行左心室插管，待插管穩(wěn)定30 分后，剃光左側胸部毛發(fā)，在胸部第二、三肋間偏左4～5 mm 處施開胸術，暴露心臟，剪開心包，在左心耳根部下方2 mm 處進針，結扎冠狀動脈，肉眼觀察結扎線以下心肌立刻出現(xiàn)黑紫，即造成急性心肌缺血模型［5］。迅速關閉胸腔縫合，各組動物均于結扎即刻或幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)ST 抬高或降低，有的可伴有T波抬高或降低，則結扎手術成功。若ST 段或T 波不抬高或不降低者棄之。

1.4 試劑和儀器

通心絡膠囊膠囊(國藥準字219980015，石家莊以嶺藥業(yè));地爾硫卓(田邊制藥株氏會社日本大阪工廠生產(chǎn)，天津田邊公司分裝，分裝批號0902002);碧血膠囊(每粒膠囊0.43 g，由上海?？松镏破酚邢薰咎峁?，批號080228);氯化硝基四氮唑藍NBT(國藥集團化學試劑有限公司，批號F10091214);MDA、SOD、LDH 和CK 試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。RM 6240 型生物信號處理采集處理系統(tǒng)和C201 型動物呼吸機:四川成都儀器廠;ECG-6511 心電圖機:上海醫(yī)療電子儀器公司;Synergy2酶標儀:美國伯騰儀器有限公司(BioTek)。

1.5 指標檢測

1.5.1 心電圖觀察 連接RM6240 型生物信號處理采集處理系統(tǒng)，記錄心電圖(ECG)，術畢，在5、10、30、60 分鐘分別進行心電圖記錄，觀察T 波的變化。

1.5.2 組織病理學觀察 取下心臟稱重，沿冠狀溝剪去大血管根部和心房，稱左心室重，并將其均勻地橫斷切成5 片，置于N-BT 染液中，在37℃恒溫水浴箱中染色15 分鐘。測量每片心肌雙側梗死區(qū)(NBT 非染色區(qū))與非梗塞區(qū)(NBT 染色區(qū))，待梗死心肌界線清楚時立即取出，切取梗死心肌并稱重。以梗死心肌與心室濕重或心臟重量的百分比做為心肌梗死面積(myocardial infarct size，MIS)［6］。

1.5.3 血清CK、LDH、SOD、MDA 含量的檢測 從大鼠腹主動脈采血3 ml 并分離血清后，嚴格按照試劑盒說明在BIOTEK 酶標儀上檢測血清中LDH、CK、SOD、MDA 的含量。

1.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5 軟件，所有結果均用均數(shù)±標準差(±s)表示，6 組資料間的上述指標(T波、CK、SOD、MDA 及心梗面積)的組間比較，各組間整體分析用單因素ANOVA 方差分析，兩兩比較用LSD 檢驗方法;LDH 應用非參檢驗Kruskal-Wallis方法分析;T 波的檢驗，用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析方法，P＜0.05 為統(tǒng)計學上差異有顯著性。

2 結果

2.1 碧血膠囊對大鼠急性心肌缺血后T 波的影響

大鼠急性心肌缺血后，與缺血前相比，各組T波均顯著升高，并且隨著缺血時間的延長有所恢復;經(jīng)重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，與AMI 組相比，假手術組，碧血膠囊高劑量組、碧血膠囊低劑量組、通心絡組、地爾硫卓組，各組在缺血的不同時間后的T波升高，都顯著低于AMI 組(P＜0.01)。這表明各用藥組在不同的時間點均能降低急性缺血后所造成的T 波的升高，見表1。圖1分別顯示了碧血膠囊用藥組與AMI 組間T 波變化的區(qū)別。

2.2 碧血膠囊對大鼠血清LDH、CK、SOD 和MDA的影響

如表2所示，大鼠急性心肌缺血后，與缺血前相比，各組LDH、CK 均升高。各用藥組CK 均降低，運用單因素方差分析，F(xiàn)=1.62，P=0.047，這表明各組間有統(tǒng)計學差異。與AMI 組相比，運用LSD 檢驗，結果顯示除碧血膠囊低劑量組(P=0.17 外)，各組均有顯著性差異(高劑量組P=0.018，通心絡組P=0.007，地爾硫卓組P=0.005)。各用藥組血清LDH 與模型組相比，有降低趨勢，運用非參檢驗Kruskal-Wallis 方法，P=0.07，這表明各組間均無顯著性差異。與模型組相比，其中各用藥組MDA 降低，運用單因素方差分析，F(xiàn)=1.07，P=0.03，這表明各組間有統(tǒng)計學差異。與AMI 組相比，運用LSD檢驗，結果顯示除碧血膠囊低劑量組(P=0.09 外)，各組均有顯著性差異(高劑量組P=0.01，通心絡組P=0.005，地爾硫卓組P=0.004)。各用藥組血清SOD 與模型組相比，有增加趨勢。運用單因素方差分析，F(xiàn)=1.2，P=0.8，這表明各組間無統(tǒng)計學差異。

表1 碧血膠囊對大鼠急性心肌缺血T 波的影響(±s，mV，n=8)

表1 碧血膠囊對大鼠急性心肌缺血T 波的影響(±s，mV，n=8)

注:與AMI 組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別 缺血前 缺血后0 min 缺血后10 min 缺血后30 min 缺血后45 min 缺血后60 min假手術組 133.4±15.2 141.8±15.1 142.7±17.3b 145.8±17.5b 144.5±19.2b 147.3±17.4 b AMI 組 120.7±4.0 260.8±43.0 309.6±19.7 322.9±20.0 350.7±30.9 345.4±30.1碧血膠囊高劑量組 132.0±10.7 172.5±16.9b 149.9±20.5b 154.1±21.2b 179.7±15.4b 171.0±12.6b碧血膠囊低劑量組 122.9±24.6 159.0±19.0b 167.7±30.0b 194.1±49.6b 188.1±45.7b 181.7±44.8b通心絡組 98.1±11.1 101.7±12.5b 130.2±15.2b 124.8±18.3b 141.4±18.6b 134.3±8.9b地爾硫卓組 127.7±17.9 160.2±30.1b 161.5±40.6b 163.4±33.7b 175.2±32.3b 159.4±27.5 b

圖1 AMI 組、碧血膠囊組結扎后T 波變化

表2 碧血膠囊對大鼠急性心肌缺血后血清LDH、CK、SOD 和MDA 的影響(±s，n=8)

表2 碧血膠囊對大鼠急性心肌缺血后血清LDH、CK、SOD 和MDA 的影響(±s，n=8)

注:與AMI 組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別 LDH(U/L)CK(μ/ML)SOD(μ/ml)MDA(nmol/ml)797±108 0.7±0.12 151.6±22.7 0.86±0.19 AMI 組 1469±154 1.2±0.10 100.5±13.6 1.91±0.31假手術組碧血膠囊高劑量組 1006±78 0.7±0.12a 137.2±36.7 1.07±0.26a碧血膠囊低劑量組 971±95 0.9±0.08 111.2±33.8 1.35±0.19通心絡組 944±157 0.6±0.14b 148.6±24.8 0.90±0.23b地爾硫卓組 916±130 0.6±0.12b 142.1±22.7 0.80±0.11 b

2.3 碧血膠囊對大鼠心肌梗死面積的影響

如表3所示，心梗面積運用單因素方差分析，F(xiàn)=1.32，P=0.000，這表明各組間有統(tǒng)計學差異。與AMI 組比較，碧血膠囊高劑量組(P=0.006)、通心絡組(P=0.000)、地爾硫卓(P=0.002)組均能顯著減少缺血所致的心肌梗死面積，碧血膠囊低劑量組(P=0.096)也能降低心肌梗死的面積，但沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。圖2顯示了大鼠AMI 模型及各用藥組的心梗面積(NBT 染色)。

表3 碧血膠囊對大鼠心肌梗塞面積的影響(±s，n=8)

表3 碧血膠囊對大鼠心肌梗塞面積的影響(±s，n=8)

注:與AMI 組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別 心室重量(g) 梗死心肌重量(g)假手術組——AMI 組 0.73±0.02 0.11±0.01b碧血膠囊高劑量組 0.67±0.01 0.07±0.01a碧血膠囊低劑量組 0.70±0.01 0.10±0.01通心絡組 0.66±0.02 0.02±0.00b地爾硫卓組 0.68±0.01 0.06±0.01 b

圖2 各組大鼠AMI 后心梗面積的變化

3 討論

結扎大鼠左冠狀動脈前降支可引起急性心肌缺血及梗死。此法所致的急性心肌損后血流動力學和心肌代謝的改變類似于人類嚴重急性心肌缺血或心肌梗死，且梗死發(fā)生快、缺血的范圍固定，故大鼠冠脈結扎法常用于抗心肌缺血藥物的研究［7-8］。本研究表明，與假手術組相比，急性心肌梗死組缺血后所致心電圖T 波高抬(超過0.1 mV)，表明急性心肌缺血、梗死的模型成功建立。

本研究采用N-BT 組織化學染色法直接測定心肌梗死范圍，同時通過檢測T 波的改變和測定血清酶學指標間接反映心肌梗死范圍及程度，結合抗脂質(zhì)過氧化指標，綜合考察碧血膠囊抗心肌缺血作用。本實驗證實，碧血膠囊能降低T 波抬高程度，明顯抑制血清CK、LDH 水平升高，這表明碧血膠囊對冠脈結扎致大鼠急性心肌缺血具有良好的保護作用。

急性心肌缺血后，血清CK、LDH 活性明顯升高，代表細胞損傷的開始，最終導致細胞死亡和組織壞死，所以酶的漏出被認為是細胞完全壞死前的改變［9-10］。本實驗證實，碧血膠囊能顯著降低CK、LDH活性，與模型組相比，CK 活性的降低有顯著性差異。(LDH 有降低趨勢，但無顯著性差異)，與縮小心肌梗死面積相吻合。冠脈結扎致心肌缺血缺氧，活性氧簇產(chǎn)生增多，而活性氧簇觸發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應又加重心肌細胞損傷［11］。通過測定內(nèi)源性抗氧化酶如SOD 活性和過氧化脂質(zhì)MDA 的變化，間接評價活性氧簇對機體造成的損傷程度。本實驗證實，碧血膠囊能明顯抑制血清MDA 水平升高，與模型組相比，有顯著性差異，并能增加血清SOD 水平的趨勢。本研究表明碧血膠囊抗心肌缺血作用機制可能是通過改善心電圖，提高心肌對缺血損傷的耐受性，對抗脂質(zhì)過氧化反應，穩(wěn)定細胞膜，保護內(nèi)源性抗氧化酶活性而發(fā)揮作用。

碧血膠囊心肌缺血作用機制可能是通過改善心外膜抗心肌缺血的機制可能與其主要成分有關。碧血膠囊主要是由三七、水蛭、絞股藍組成。它具有活血化瘀，降低血液黏滯度，改善心肌缺血缺氧，降低血脂等作用［1-3］。現(xiàn)代藥理研究表明，三七的主要活性成分為三七總皂苷具有明顯的降低心肌耗氧量、改善心肌缺血、降血脂、防止動脈粥樣硬化、抗心律失常等作用［10-11］。徐靈建等［12］報道了復方水蛭精膠囊能降低心肌缺血再灌后脂質(zhì)過氧化物，升高血清SOD 濃度，降低cAMP 值，降低全血黏度、血漿黏度、降低心肌梗死范圍。熊維生等［13］報道絞股藍的主要成份絞股藍皂苷能縮小家兔心肌梗死范圍，抑制心梗后游離脂肪酸升高，降低梗死心肌MDA 含量，并能抗缺血及再灌注損傷作用，其機理可能與抗脂質(zhì)過氧化有關。

以上結果提示，碧血膠囊抗心肌缺血作用機制可能通過三七、絞股藍、水蛭等成分的共同作用，改善心電圖，提高心肌供血，對抗脂質(zhì)過氧化反應，穩(wěn)定細胞膜，保護內(nèi)源性抗氧化酶活性，從而降低MIS，進而起到保護缺血心肌的作用，本研究為碧血膠囊防治冠心病心肌缺血，減少心肌梗死的發(fā)生率提供了實驗依據(jù)，其是否亦通過影響鈣超載以及其它調(diào)節(jié)發(fā)揮改善AMI 后心功能的藥理作用機制尚待進一步較深入研究。

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