趙巖 蔣洪 嘎魯 米雪 楊慧

肝臟腫瘤是常見的惡性腫瘤之一，它病程短，死亡率高，對人類健康威脅極大。去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是斑蝥素的衍生物，是中國自主研發(fā)的具有較強(qiáng)抗腫瘤活性和獨(dú)特升高白細(xì)胞、保護(hù)肝細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫等作用的新型抗腫瘤藥物［1］，其毒性明顯比斑蝥素低，而抗腫瘤作用優(yōu)于斑蝥素［2］，臨床上用于肝癌的治療或輔助治療，顯示出較好的療效［3］。

NCTD 主要以片劑和注射劑應(yīng)用于臨床，魏春明等［4］研究了去甲斑蝥素小鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)與組織分布，研究結(jié)果顯示，小鼠口服3H-去甲斑蝥素吸收迅速，肝臟分布少且消除快，腎臟則分布多，但消除也快。體內(nèi)分布結(jié)果表明NCTD 用于治療肝癌到達(dá)靶器官的濃度低，因此不僅藥效減弱，而且對其他臟器有較大的毒性。為更好的發(fā)揮其療效，降低毒副作用，延長作用時(shí)間，藥學(xué)工作者就其肝靶向性藥物設(shè)計(jì)進(jìn)行大量的研究，取得了一定進(jìn)展。靶向藥物設(shè)計(jì)是通過優(yōu)化藥物傳輸過程，使藥物按照預(yù)定目標(biāo)到達(dá)某器官、組織或靶點(diǎn)，增加藥物在靶點(diǎn)或作用部位的生物利用度，同時(shí)減少在其他部位的作用，以減少毒副作用，提高治療效果的一種設(shè)計(jì)方法［5］。實(shí)現(xiàn)藥物的主動肝靶向傳輸過程的靶向藥物設(shè)計(jì)是依據(jù)受體—配體結(jié)合或抗原—抗體結(jié)合等生物特異性相互作用原理。近幾年進(jìn)行的去甲斑蝥素主動肝靶向的研究主要有單克隆抗體導(dǎo)向藥物，去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的前體藥物及表面修飾的納米粒和脂質(zhì)體等。

1 單克隆抗體導(dǎo)向NCTD 主動肝靶向藥物研究

將單克隆抗體作為特異性載體與藥物的功能基或與經(jīng)過修飾后的功能基團(tuán)相連結(jié)，生成單克隆抗體—藥物偶聯(lián)物，制成導(dǎo)向藥物，利用單克隆抗體特異性趨向于抗原的特性，將藥物高濃度地輸送到靶點(diǎn)細(xì)胞表面，再經(jīng)化學(xué)或酶催化方式斷裂偶聯(lián)鍵分解出藥物原型，在作用靶點(diǎn)細(xì)胞局部形成可以產(chǎn)生藥理活性所需要的藥物濃度而發(fā)揮作用，從而減少藥物向非靶位的分布和結(jié)合，降低藥物的毒副作用。

梁福佑等［6］采用抗人肝癌大鼠單克隆抗體3A5與去甲斑蝥素偶聯(lián)，以克隆生成法觀察偶聯(lián)物經(jīng)靜脈給藥和腫瘤局部給藥對腫瘤的治療作用，結(jié)果顯示偶聯(lián)物對裸鼠移植人肝癌BEL-7402 細(xì)胞具有比去甲斑蝥素更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。靜脈給藥時(shí)，去甲斑蝥素和其偶聯(lián)物對腫瘤的抑制率分別為15% 和63%，瘤結(jié)周圍給藥時(shí)，去甲斑蝥素和其偶聯(lián)物對腫瘤的抑制率分別為47%和78%，提示偶聯(lián)物對靶細(xì)胞的殺傷力強(qiáng)于游離去甲斑蝥素，說明單克隆抗體3A5 與去甲斑蝥素偶聯(lián)物對肝臟腫瘤具有良好的導(dǎo)向性。單抗偶聯(lián)物雖具有體內(nèi)分布特異性，但因單抗偶聯(lián)物為大分子物質(zhì)，較難穿過細(xì)胞外間隙到達(dá)實(shí)體瘤的深部，因此到達(dá)腫瘤細(xì)胞的藥物量仍屬有限，這也是研究單抗偶聯(lián)物時(shí)需解決的問題之一。

2 受體介導(dǎo)NCTD 主動肝靶向藥物研究

受體與配基的結(jié)合具有高度的專一性，受體的結(jié)合部位能夠?qū)Ｒ恍缘淖R別相應(yīng)配基并與之結(jié)合，這種局部結(jié)構(gòu)的專一性匹配是受體介導(dǎo)靶向藥物的理論基礎(chǔ)［5］。

2.1 去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)NCTD 的研究

去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是一種表達(dá)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面的專一性識別末端含有半乳糖或乙酰氨基半乳糖的糖蛋白去唾液酸糖蛋白受體，又稱半乳糖受體。由于半乳糖殘基修飾藥物在體內(nèi)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，以及其修飾較為方便，且其修飾物具有較好的靶向性等諸多優(yōu)點(diǎn)，以半乳糖殘基為配體修飾藥物來實(shí)現(xiàn)肝靶向是去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的肝靶向研究中最多的［7-10］。通常將藥物或載體等經(jīng)半乳糖糖基化制成以ASGPR 受體為介導(dǎo)的肝靶向前體藥物或半乳糖基修飾的載藥微粒［11-13］。

2.1.1 NCTD 半乳糖化前藥 前體藥物簡稱前藥，是活性藥物經(jīng)過化學(xué)修飾后得到的化合物，在體內(nèi)通過酶的作用又轉(zhuǎn)化為原來的藥物而發(fā)揮藥效，以利于藥物的吸收、分布、代謝和排泄［1］。因此，能通過改變靶器官的pH 值和某些酶的活性來實(shí)現(xiàn)母藥的定位釋放。

范峰等［14］以去甲斑蝥素為原料，以各種小分子氨基酸修飾后，過?；浣?、糖苷化和脫乙?；磻?yīng)，合成了去甲斑蝥素—半乳糖衍生物(見圖1)，期望得到肝靶向抗癌前藥。對產(chǎn)物a(見圖1)進(jìn)行初步小鼠體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，化合物a 中、高劑量組抑瘤率明顯高于NCTD 組，表明半乳糖苷化對NCTD 的抗癌作用有一定提高，肝靶向性有待進(jìn)一步的研究。

圖1 范峰等合成的去甲斑蝥素—半乳糖衍生物

胡展紅等［11］以乙二胺為連接臂將去甲斑蝥素和乳糖酸連接合成了前體藥物乳糖化—去甲斑蝥素(1actosyl-norcantharidin，Lac-NCTD)(見圖2)，期望利用分子結(jié)構(gòu)上的半乳糖殘基被體內(nèi)肝細(xì)胞的AS-GP-R 特異性識別，達(dá)到主動肝靶向性的目的。急性毒性研究結(jié)果顯示Lac-NCTD 的毒性遠(yuǎn)小于NCTD，是一種安全無毒的新化合物［12］。

圖2 胡展紅等合成的乳糖化去甲斑蝥素

2.1.2 半乳糖修飾的NCTD 納米粒 納米粒是大小在10～1000 nm 之間的固態(tài)膠體顆粒，可作為傳輸藥物的載體，將藥物包封于納米粒中，可調(diào)節(jié)釋藥速度、增加生物膜的通透性、改變藥物在體內(nèi)的分布以及提高藥物生物利用度等［13］。對納米粒進(jìn)行表面修飾，如在其表面耦聯(lián)特異性的靶向分子(特異性的配體、單克隆抗體等)，納米粒可通過靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)主動靶向治療［15］。

胡展紅等［16］、管敏等［17］采用噻唑基四唑比色法考察NCTD、Lac-NCTD 及乳糖化-去甲斑蝥素納米粒(Lactose-oriented-to cantharidin nanoparticles，Lac-NCTD-NPs)對腫瘤細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721 和SGC-7901 的細(xì)胞毒作用;通過H22 荷瘤小鼠模型考察藥物體內(nèi)對肝癌的抑制作用。體外細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，Lac-NCTD 及Lac-NCTD-NPs 對上述腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)抑制活性;小鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Lac-NCTD-NPs 中劑量的抑瘤率為63.9%，顯著高于相同濃度的NCTD 和Lac-NCTD。說明Lac-NCTD-NPs 能有效地靶向于肝腫瘤組織，抑制腫瘤的生長，是一種較強(qiáng)的具有體內(nèi)外抗癌活性的新型肝靶向性制劑。

管敏等［18］采用Caco-2 細(xì)胞單層模型，研究了Lac-NCTD 及Lac-NCTD-NPs 的細(xì)胞攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。得到結(jié)論:Lac-NCTD 主要以主動轉(zhuǎn)運(yùn)方式被吸收，少部分通過旁路轉(zhuǎn)運(yùn)被Caco-2 細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，此過程受P-糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白2 外排蛋白的影響，且藥物納米粒的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)較其溶液均有增加。在細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)中，Lac-NCTD-NPs 的攝取量、滲透系數(shù)均比相同質(zhì)量濃度Lac-NCTD 溶液的對應(yīng)值要大，提示殼聚糖包裹的Lac-NCTD 納米粒制劑有利于細(xì)胞的藥物吸收。

殼聚糖是生物可降解并和生物相容、天然無毒的高分子堿性氨基多糖，帶正電荷，具有獨(dú)特的跨細(xì)胞膜能力。腫瘤細(xì)胞具有比正常細(xì)胞表面更多的負(fù)電荷，殼聚糖在酸性環(huán)境中選擇性吸附腫瘤細(xì)胞表面并起電中和作用，能直接抑制腫瘤細(xì)胞，通過活化免疫系統(tǒng)抑制腫瘤細(xì)胞活性，文獻(xiàn)研究報(bào)道［19-21］將半乳糖基引入到殼聚糖的結(jié)構(gòu)有望成為潛在的肝靶向載體。

匡長春等［22］研究去甲斑蝥素殼聚糖納米粒在小鼠體內(nèi)的分布并以靶向指數(shù)targeting index，TI)判斷其對主要臟器的靶向性。結(jié)果顯示去甲斑蝥素殼聚糖納米粒在肝臟中的濃度明顯高于去甲斑蝥素，具有明顯的靶向作用，對其他組織則無靶向作用。

胡瑋等［23］以N-乳糖酰殼聚糖為載體，制備去甲斑蝥素N-乳糖酰殼聚糖納米粒(Norcantharidin Nlactose-chitosan nanoparticles，NCTD-GC-NPs)，去甲斑蝥素殼聚糖納米粒(norcant-haridin chitosan nanoparticles，NCTD-CS-NPs)并以H22 荷瘤小鼠為腫瘤模型動物，考察NCTD，NCTD-CS-NPs 及NCTD-GCNPs 在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性，實(shí)驗(yàn)顯示，NCTDGC-NPs 在體內(nèi)具有良好的肝靶向抗腫瘤活性;組織切片直觀反映出納米粒制劑尤其是乳糖酸殼聚糖納米可增強(qiáng)NCTD 對腫瘤的殺傷作用，表明去甲斑蝥素N-乳糖酰殼聚糖納米粒在體外可發(fā)揮雙重靶向作用，顯著提高藥物的抗腫瘤作用。

2.1.3 半乳糖修飾的NCTD 脂質(zhì)體 脂質(zhì)體作為藥物被動靶向的一種主要載體，經(jīng)靜脈給藥后，主要被肝臟的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞所吞噬并進(jìn)一步消除，極少到達(dá)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。采用受體介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞靶向是一種非常有效的措施，其中半乳糖受體的研究最為廣泛和深入［24］。

姜華等［7］制備半乳糖衍生物修飾去甲斑蝥酸鈉脂質(zhì)體(galactose norcantharidin liposomes，GNL)，以半乳糖為起始物，經(jīng)乙?；?、溴代、縮合、置換后得化合物Galβ1-(CH2-CH2-O)2-C14-H29 作為修飾靶向材料，制備了去甲斑蝥酸鈉脂質(zhì)體和GNL，利用RP-HPLC 測定小鼠尾靜脈注射給藥后小鼠肝臟中的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)表明脂質(zhì)體表面經(jīng)化合物Galβ1-(CH2-CH2-O)2-C14-H29 修飾后，GNL 肝臟靶向效率是去甲斑蝥酸鈉脂質(zhì)體的1.8 倍，是去甲斑蝥酸鈉注射液的2.9 倍。由此說明在脂質(zhì)體表面結(jié)合能被肝細(xì)胞特異識別的半乳糖苷，形成半乳糖受體介導(dǎo)的脂質(zhì)體，有望成為更為理想的肝靶向藥物載體。

Lac-NCTD 的水溶性高，使其脂質(zhì)體的包封率極低，直接影響了藥物的生物利用度。周奕等［25］將乳糖化-去甲斑蝥素與磷脂按一定配比，制備成乳糖化去甲斑蝥素磷脂復(fù)合物，旨在改善藥物的脂溶性進(jìn)而提高其在體內(nèi)的吸收，同時(shí)制備pH 敏感型脂質(zhì)體可控制脂質(zhì)體在腫瘤部位的釋放，從而提高藥效，降低毒性。

2.2 甘草次酸受體介導(dǎo)的NCTD 脂質(zhì)體的研究

近年來，一種新型的肝特異性配基甘草皂苷及其苷元甘草次酸正在引起人們的關(guān)注［24］。Negishi證實(shí)了大鼠肝細(xì)胞膜上含有豐富的甘草次酸及甘草酸特異性結(jié)合位點(diǎn)［26］，隨后的研究也證實(shí)甘草次酸/甘草酸修飾的載體有趨肝性［27］。

吳超等［28］利用薄膜分散法制備甘草次酸衍生物甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷(Stearin glycyrrhetinic acid ester-3-O-galactosidase，Gal-GAOSt)修飾去甲斑蝥素脂質(zhì)體后，經(jīng)小鼠尾靜脈給藥，采用HPLC 法檢測去甲斑蝥素在小鼠肝腎中的濃度隨時(shí)間的變化，與去甲斑蝥素水溶液組進(jìn)行比較血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(area under concentration-time curve，AUC)并以靶向指數(shù)TI=(AUC)NC-SOL/(AUC)Gal-GAOStNC-LP來判斷甘草次酸衍生物修飾去甲斑蝥素脂質(zhì)體(Gal-GAOStNC-LP)對主要器官的靶向性。結(jié)果顯示，Gal-GAOStNC-LP 具有肝靶向性，并且被修飾的脂質(zhì)體靶向性明顯，能提高藥物療效，降低毒副作用。

3 結(jié)語與展望

去甲斑蝥素單抗偶聯(lián)物，半乳糖介導(dǎo)的肝靶向前體藥物，半乳糖基修飾的納米粒及脂質(zhì)體等，它們都不同程度地提高了肝靶向性，增加了藥物在肝腫瘤細(xì)胞中的濃度，降低了毒副作用，但也存在著一些需解決的問題，如不能口服，需注射給藥;載藥量有限，投放的藥物到達(dá)靶組織濃度低，難以達(dá)到足夠治療劑量等。這也促使人們尋找更佳的主動肝靶向載體，如新型的甘草次酸衍生物，膽酸等都可作為去甲斑蝥素主動肝靶向傳輸系統(tǒng)中的載體進(jìn)行研究。相信通過廣泛深入的研究，有望開發(fā)出應(yīng)用于臨床的主動肝靶向去甲斑蝥素藥物。

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