郭尋竹，宋麗萍

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，遼寧錦州 121001

兔動(dòng)脈粥樣硬化模型血清TNF-α與斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究

郭尋竹，宋麗萍

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，遼寧錦州 121001

目的探討TNF-α在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中的作用。方法10只雄性大耳白兔隨機(jī)分為模型組(A組)和正常對(duì)照組(B組)，每組5只。模型組通過(guò)球囊損傷腹主動(dòng)脈內(nèi)膜，并飼喂高脂飼料15周；對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng)15周。于實(shí)驗(yàn)前及15周末，經(jīng)耳緣靜脈空腹取血，進(jìn)行血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholested，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholested，LDL-C)、TNF-α的測(cè)定，并處死動(dòng)物分離腹主動(dòng)脈，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察，TUNEL免疫組化檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果兔動(dòng)脈粥樣硬化模型制備成功。模型組與對(duì)照組比較，TG、TC、LDL-C、TNF-α均顯著增高(P均＜0.05)。TG、TC、LDL-C與TNF-α均呈顯著正相關(guān)(P均＜0.05)，與HDL無(wú)明顯相關(guān)性。模型組血清TNF-α水平與腹主動(dòng)脈斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)。結(jié)論TNF-α可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡，血清TG、TC、LDL-C、TNF-α是動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。

動(dòng)脈粥樣硬化；血脂；腫瘤壞死因子

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種全身、彌漫性的血管壁慢性炎癥性疾病，可導(dǎo)致許多重要器官尤其是心、腦、腎等的改變，其病理過(guò)程與炎癥因子密切相關(guān)[1-2]，是危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)疾病之一。多種炎癥因子如TNF-α、INF-γ、IL-6等參與了其病變過(guò)程，細(xì)胞凋亡也參與了AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[3]。本研究通過(guò)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型血清TNF-α及腹主動(dòng)脈血管片段細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，探討二者在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中的作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性大耳白兔10只，體質(zhì)量2.5 ～3.5 kg，均由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。家兔分籠飼養(yǎng)于溫度18 ～ 24℃，光照明暗各12 h清潔的飼養(yǎng)室內(nèi)。

2 材料與試劑 普通飼料：遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。膽固醇購(gòu)自安徽天啟化工科技有限公司。蛋黃粉及豬油均為市售。高脂飼料配制：膽固醇2%、蛋黃粉10%，熟豬油5%均勻混合于普通飼料，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心配制。兔血清TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自上海朗頓生物科技有限公司。

3 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型的制備 10只雄性大耳白兔，隨機(jī)分為模型組和正常對(duì)照組，每組各5只。模型組給予高脂飲食(內(nèi)含2%的膽固醇和5%豬油)飼養(yǎng)2周后，10%水合氯醛(3 ml/kg)靜脈注射麻醉動(dòng)物，腹股溝區(qū)觸摸股動(dòng)脈搏動(dòng)，縱向切開(kāi)皮膚，分離皮下組織，鈍性分離股動(dòng)脈、靜脈和神經(jīng)。切開(kāi)股動(dòng)脈，球囊導(dǎo)管插入股動(dòng)脈，上行插入約30 cm后，給球囊注入0.9%氯化鈉注射液0.2 ml，向下拖拉球囊至髂總動(dòng)脈分叉處，反復(fù)3次。縫合動(dòng)脈切口和皮膚，青霉素80萬(wàn)U腹腔注射3 d，防止感染。術(shù)后繼續(xù)給予含2%膽固醇和5%豬油的高脂飼料15周。正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)15周。

4 血標(biāo)本采集與檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)前及15周末處死動(dòng)物前禁食≥12 h，經(jīng)耳緣靜脈空腹取血收集于生化試管中，靜置后離心分離血清，取上清液放置于-80℃待檢。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholested，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholested，LDL-C)。酶聯(lián)免疫法測(cè)定TNF-α的濃度。

5 病理 于15周末，模型組和對(duì)照組兔，注射過(guò)量的10%水合氯醛處死動(dòng)物，進(jìn)行解剖。小心暴露動(dòng)物心臟與髂總動(dòng)脈分叉之間的胸腹主動(dòng)脈，清除附著于動(dòng)脈上的脂肪與組織，取出腹主動(dòng)脈。將離體血管標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片，行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。取石蠟切片行原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)，正常細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，凋亡細(xì)胞核呈棕色。隨機(jī)取5個(gè)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值，計(jì)算凋亡細(xì)胞指數(shù)(AI，%) = (凋亡細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù))×100%。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)分析法；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AS模型制備情況 經(jīng)球囊損傷血管內(nèi)皮及高脂飲食后，15周后模型組腹主動(dòng)脈AS模型制備成功。光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)纖維帽形成，脂質(zhì)壞死中心，細(xì)胞外基質(zhì)及平滑肌細(xì)胞很少(圖1)。對(duì)照組主動(dòng)脈光鏡下顯示：正常主動(dòng)脈壁、內(nèi)膜、中膜、外膜均清晰可見(jiàn)，各層結(jié)構(gòu)正常(圖2)。模型組AS斑塊中的細(xì)胞凋亡比對(duì)照組多，凋亡指數(shù)分別為(33.51±9.87)%和(15.41±6.14)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3、圖4。

2 兩組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C比較 15周時(shí)，對(duì)照組TC、TG、HDL-C和LDL-C水平同實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而模型組與實(shí)驗(yàn)前及對(duì)照組比較TC、TG、LDL-C顯著增高(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

3 兩組血清TNF-α水平比較 15周后對(duì)照組血清TNF-α水平同實(shí)驗(yàn)前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而模型組血清TNF-α水平與實(shí)驗(yàn)前及對(duì)照組比較顯著增高(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

4 TNF-α與血脂的相關(guān)分析 血清TNF-α水平與血清TC，TG及LDL-C水平均呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。與HDL-C無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

圖 1 球囊損傷組兔動(dòng)脈粥樣硬化HE 染色切片圖(×200)可見(jiàn)大的脂質(zhì)壞死中心，并有薄的纖維帽圖 2 正常兔腹主動(dòng)脈內(nèi)皮HE 染色切片圖(×200)圖 3 模型組血管片段TUNEL 檢測(cè)結(jié)果，凋亡細(xì)胞核為棕色圖 4 對(duì)照組血管片段TUNEL 檢測(cè)結(jié)果，正常細(xì)胞核為藍(lán)紫色，凋亡細(xì)胞核為棕色Fig. 1 A large lipid necrosis center with thin fbrous cap in HE-stained section of rabbit abdominal aorta artherosclerotic tissue(×200)Fig. 2 Normal HE-stained section of rabbit abdominal aorta endothelial tissue (×200)Fig. 3 TUNEL showing blood vessel segments with brown apoptotic nuclei in model groupFig. 4 TUNEL showing blood vessel segments with bluish violet normal nuclei and brown apoptotic nuclei in control group

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔血脂水平的變化Tab. 1 Serum lipid level in experimental rabbits (mmol/L, n=5)

表2 各組實(shí)驗(yàn)兔血清TNF-α的變化Tab. 2 Serum TNF-α level in experimental rabbits(ng/L)

表3 模型組15周血清TNF-α與TC, TG, LDL-C, HDL-C的相關(guān)分析Tab. 3 Correlation between serum TNF-α level and serum levels of TC, TG, LDL-C, HDL-C in model group at 15th week(n=5)

5 模型組TNF-α與腹主動(dòng)脈血管內(nèi)皮凋亡指數(shù)的相關(guān)性 模型組15周血清TNF-α水平與腹主動(dòng)脈斑塊內(nèi)凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.912(P＜0.05)。

討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)緩慢而復(fù)雜的病理過(guò)程[4]，是冠心病和缺血性腦卒中的主要病因[5]。而炎癥是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變起始和發(fā)展的主要因素。一些文獻(xiàn)報(bào)道，AS斑塊內(nèi)的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等可分泌多種炎性因子如IL-1β、IL-6、INF-α和IFN-γ等，這些炎癥因子產(chǎn)生更多細(xì)胞因子，進(jìn)一步加重了粥樣斑塊的發(fā)展[6]。TNF-α和IL-6是強(qiáng)烈的促炎性細(xì)胞因子，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和破裂中起到重要作用[7]。

TNF-α是由激活的巨噬細(xì)胞或非巨噬細(xì)胞如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生的一種多肽。TNF-α主要參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、促進(jìn)炎性細(xì)胞的聚集和炎性介質(zhì)的釋放[8]，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)TNF-α的水平明顯增高，林秋雄等[9]發(fā)現(xiàn)兔動(dòng)脈粥樣硬化模型血清TNF-α水平明顯高于對(duì)照組，而常炳堃和呂曉東[10]發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠心臟組織中TNF-α的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。

本研究結(jié)果顯示：兔動(dòng)脈粥樣硬化組血清TNF-α水平明顯高于對(duì)照組。與文獻(xiàn)報(bào)道一致。其主要原因?yàn)椋篈S病灶內(nèi)的巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生大量TNF-α。此外，AS病灶內(nèi)的血管平滑肌細(xì)胞和激活的T淋巴細(xì)胞也可產(chǎn)生TNF-α。表明TNF-α可作為動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)測(cè)的危險(xiǎn)因子。

本研究結(jié)果還證實(shí)：血清TNF-α水平與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)。分析其原因：動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在多種細(xì)胞的凋亡與壞死，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[11]。而在AS斑塊中由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞分泌的炎性介質(zhì)TNF-α，又可以促進(jìn)和誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為：血脂異常是AS形成的主要危險(xiǎn)因素[12]，脂質(zhì)代謝紊亂與動(dòng)脈粥樣硬化的形成密切相關(guān)，研究顯示：血脂持續(xù)異常是促進(jìn)AS發(fā)生及發(fā)展的重要因素[13]。LDL-C已被證實(shí)是動(dòng)脈粥樣硬化疾病的主要危險(xiǎn)因素[14]，LDL-C的促AS作用已被大量實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，降低LDL-C也成為AS相關(guān)性疾病的防治措施之一[15]。HDL在生理活動(dòng)中起到重要作用，可降低膽固醇的含量，從根本上有效預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化。本研究中模型組TG、TC、LDL-C水平明顯高于對(duì)照組。同時(shí)病理學(xué)證實(shí)：模型組有動(dòng)脈粥樣斑塊形成。這說(shuō)明模型組球囊損傷加高脂飲食促進(jìn)了兔血管內(nèi)膜粥樣斑塊的形成。

本研究結(jié)果還證實(shí)：血清TNF-α水平與血清TC，TG及LDL-C水平均呈顯著正相關(guān)，與HDL-C無(wú)相關(guān)性。表明TNF-α與血脂關(guān)系密切，有可能共同參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，但還有待進(jìn)一步研究。

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Correlation between serum TNF-α level and apoptosis in rabbit atherosclerotic plaque model

GUO Xun-zhu, SONG Li-ping
Department of Nuclear Medicine, First Affliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China Corresponding author: SONG Li-ping. Email: lipingsong188@163.com

ObjectiveTo study the role of serum TNF-α level in formation of atherosclerotic plaques. MethodsTen male big ear rabbits were randomly divided into model group (group A, n=5) and normal control group (group B, n=5). After damage to abdominal aorta intima was induced with balloon, the animals in group A were fed with high fat diet for 15 weeks while those in group B were fed with normal diet for 15 weeks. Fasting blood was taken from the ear marginal vein to measure the serum levels of TC, TG, HDL-C, LDL-C and TNF-α before and by the end of week 15. The animals were killed. Their abdominal aorta was isolated and observed under optical microscope. Apoptosis was detected by TUNEL. ResultsThe animal atherosclerosis model was successfully established. The serum levels of TC, TG, LDL-C and TNF-α were significantly higher in group B than in group A (P＜0.05). The serum levels of TC, TG and LDL-C were positively related with the serum TNF-α level (P＜0.05). However, the serum HDL-C level was not signifcantly related with the serum TNF-α. level. The serum TNF-α level was positively related with the apoptosis index in abdominal aorta plaques. ConclusionTNF-α may be involved in apoptosis in atherosclerotic plaques. Serum levels of TG, TC, LDL-C and TNF-α are the risk factor for atherosclerosis.

atherosclerosis; blood lipid; TNF-α

R 543.3

A

2095-5227(2014)02-0174-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.02.022

2013-11-04 10:46

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20131104.1046.001.html

2013-09-16

遼寧省科技廳資助項(xiàng)目(201102129)

Supported by the Science and Technology Committee Foundation of Liaoning Province(201102129)

郭尋竹，女，學(xué)士，主治醫(yī)師。研究方向：核心臟病學(xué)。Email: guoxunzhu0416@163.com

宋麗萍，女，博士，教授。Email: lipingsong188@163.com