韓 銘，張金英，宋翠紅，梁 辰，馮 杰，顏光濤

解放軍總醫(yī)院 基礎(chǔ)所生化室，北京 100853

瘦素減輕魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷

韓 銘，張金英，宋翠紅，梁 辰，馮 杰，顏光濤

解放軍總醫(yī)院 基礎(chǔ)所生化室，北京 100853

目的探討瘦素對魚藤酮(rotenone)所誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的抑制作用。方法建立魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型，用瘦素進(jìn)行干預(yù)，采用MTT比色法檢測細(xì)胞存活率，錐蟲藍(lán)檢測細(xì)胞死亡率，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，并用Western blot法檢測Bcl-2、Bax、p-GSK-3β(Ser9)和GSK-3β的表達(dá)水平，免疫熒光檢測α-synuclein的表達(dá)水平。結(jié)果成功建立了魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型。在模型的基礎(chǔ)上，瘦素干預(yù)后，細(xì)胞狀態(tài)改善，細(xì)胞存活率提高約14%(P＜0.05)，細(xì)胞死亡率降低約17%(P＜0.05)，α-synuclein的濃度下降，Bcl-2和p-GSK-3β的表達(dá)顯著提高。結(jié)論瘦素對魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有明顯的抑制作用，可能是通過抑制GSK-3β的活性上調(diào)Bcl-2/Bax的比率和降低α-synuclein的表達(dá)而得以實(shí)現(xiàn)。

魚藤酮；SH-SY5Y細(xì)胞；瘦素

SH-SY5Y細(xì)胞系是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)、生理和生化功能與正常神經(jīng)細(xì)胞相似，并具有許多多巴胺能神經(jīng)元的特點(diǎn)，可以合成多巴胺和去甲腎上腺素的能力和表達(dá)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此，SH-SY5Y細(xì)胞近年來被用來作為帕金森病研究的神經(jīng)元模型[1]。

魚藤酮是一種廣泛使用且被認(rèn)為“安全可靠”的農(nóng)藥，在蔬菜和魚中會有少量殘留，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)魚藤酮是帕金森病的一種危險因素，被認(rèn)為是一種人類容易少量長期接觸的環(huán)境毒素[2]。α-突觸核蛋白(α-synuclein)是路易小體的重要組成部分，其過表達(dá)和錯誤折疊與帕金森病相關(guān)。而魚藤酮能導(dǎo)致α-synuclein的表達(dá)增多，并最終聚集，而能很好地模擬帕金森病模型[3]。因此魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞通常作為帕金森病的細(xì)胞模型。

糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK-3β)作為一種調(diào)控糖原代謝的主要激酶，可使多種底物蛋白磷酸化，最近研究表明，GSK-3β與帕金森病發(fā)生密切相關(guān)[4]。瘦素主要由白色脂肪組織分泌，通過下丘腦來調(diào)節(jié)新陳代謝、攝食、能量平衡等生理活動。Vannucci等研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠與正常小鼠比較大腦體積明顯縮小，并伴有神經(jīng)元密度減低和功能下降，提示瘦素可能參與神經(jīng)系統(tǒng)生理活動[5]。本實(shí)驗(yàn)建立魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞模型，采用瘦素保護(hù)該模型，擬初步闡明瘦素減輕魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制。

材料和方法

1 材料 人神經(jīng)纖維母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SHSY5Y(本實(shí)驗(yàn)室保藏)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibico公司)；二甲基亞砜(DMSO)，魚藤酮(rotenone)、MTT、錐蟲藍(lán)(sigma公司)；人重組瘦素(peprotech公司)；一抗：α-synuclein、Bax抗體(Epitomics公司)，Bcl-2、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)抗體(Cell Signaling Technology公司)、β-actin抗體(Santa Cruz公司)；二抗：山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶(北京中杉金橋公司)、山羊抗兔IgG/Cy3標(biāo)記(武漢博士德生物工程公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris堿)(北京益利精細(xì)化學(xué)品公司)；Western blot超敏發(fā)光液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)公司)。

2 MTT檢測魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的存活率將SH-SY5Y細(xì)胞(6×104個/ml)200 μl接種于96孔板，每組設(shè)12個平行孔，培養(yǎng)24 h后加入魚藤酮，使終濃度達(dá)到0、0.005、0.05、0.5、5 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其中0組為對照組(魚藤酮用DMSO溶解，DMSO終濃度為0.1%)。然后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μl DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)直至紫色化合物全部溶解，振蕩器上振蕩10 min后，酶標(biāo)儀570 nm，對比波長650 nm，測定吸光值，其值相對于對照組的比值，其中每組第1組均為對照組。

3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞豐度達(dá)到60%，加入5 μmol/L魚藤酮誘導(dǎo)24 h，建立模型。在魚藤酮誘導(dǎo)前2 h，加入瘦素于培養(yǎng)基中，終濃度為2 μg/ml，對SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)(后續(xù)試驗(yàn)，瘦素預(yù)處理和模型建立均采用此法)。置于倒置顯微鏡下觀察，200×倍數(shù)下拍照。

4 MTT法檢測瘦素對于魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響 將SH-SY5Y細(xì)胞(6×104個/ml)200 μl接種于96孔板，每組設(shè)12個平行孔，共3組，培養(yǎng)24 h后其中一組加入瘦素，終濃度為2 μg/ml，2 h后瘦素組和另外一組加入終濃度為5 μmol/L的魚藤酮，剩下的一組加入DMSO(魚藤酮用DMSO溶解，DMSO終濃度為0.1%)。然后按照方法2的MTT檢測。

5 錐蟲藍(lán)法檢測瘦素對于魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞死亡的影響 以2×105個/孔種將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞種于24孔板中，設(shè)8個平行孔，待瘦素預(yù)處理和模型建立之后，消化并制備單細(xì)胞懸液，適當(dāng)稀釋后，將細(xì)胞懸液與0.4%錐蟲藍(lán)溶液以9∶1混合混勻(終濃度0.04%)。在3 min內(nèi)，分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。細(xì)胞死亡率(%)=死細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

6 免疫熒光檢測α-synuclein的表達(dá)水平 以2× 105個/孔的密度接種SH-SY5Y細(xì)胞于Confocal專用小皿中，待瘦素預(yù)處理和模型建立(同方法3)之后，50%的羊血清封閉1 h，加入α-synuclein的一抗過夜，PBS洗3遍，每次5 min，然后加入Cy3標(biāo)記的二抗孵育，PBS再洗3遍，每次5 min，置于熒光顯微鏡下觀察，100×倍數(shù)下拍照，成紅色熒光。

7 Western blot檢測Bcl-2、Bax和GSK-3β磷酸化的表達(dá)水平 采用Western blot法，將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞以1×106個/孔種于6孔板中，待完全貼壁后，用不同濃度的魚藤酮(0，0.005，0.05，0.5，5 μmol/L)處理(其中0組為對照組)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后收集細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白上樣量為50 μg，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDSPAGE上進(jìn)行垂直電泳，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(100 V，110 min)，5%脫脂奶粉(TBST溶解，下同)封閉1 h，然后一抗，Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)、β-actin(1∶500)、p-GSK-3β(Ser9)(1∶1 000)和GSK-3β(1∶1 000)。-4℃封閉過夜，TBST漂洗膜3次，每次10 min，然后二抗(1∶4 000)，37℃孵育40 min，TBST漂洗3次，每次10 min，最后曝光顯影。掃描后，使用Image Plus 6.0軟件，分析其灰度值，3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)求平均值。同理，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行瘦素預(yù)處理和模型建立(同方法3)，但瘦素預(yù)處理的終濃度有兩種，分別為0.5 μg/ml和2 μg/ml，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后Western blot和分析。

8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Stata 7.0軟件統(tǒng)計進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 魚藤酮對SH-SY5Y細(xì)胞的存活率影響 MTT法檢測SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯示，魚藤酮的濃度在0.5 μmol/L，5 μmol/L時，細(xì)胞存活率在60%以下，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(aP＜0.05)(圖1)。后續(xù)模型的建立采用5 μmol/L魚藤酮進(jìn)行誘導(dǎo)，存活率僅46%。

圖 1 不同濃度的魚藤酮對細(xì)胞活性的影響(aP＜0.05, vs 對照組)Fig. 1 Effect of different rotenone concentrations on cell activity (aP＜0.05, vs control group)

2 瘦素對于魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(200×下觀察)，正常SH-SY5Y細(xì)胞在接種貼壁后呈梭形狀(圖2A)，5 μmol/L模型組細(xì)胞梭形減少，圓形皺縮變多(圖2B)，在5 μmol/L魚藤酮誘導(dǎo)之前加入2 μg/ml瘦素組(圖2C)，其細(xì)胞相對于不加瘦素組，細(xì)胞狀態(tài)有所改善，梭形細(xì)胞增多。

3 瘦素預(yù)處理后對于魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞存活率和死亡率的影響 MTT法檢測SH-SY5Y細(xì)胞存活率，錐蟲藍(lán)檢測SH-SY5Y死亡率，顯示2 μg/ml瘦素可以提高5 μmol/L的魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y的存活率約14%(圖3A)，降低死亡率約17%(圖3B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

4 瘦素降低了魚藤酮誘導(dǎo)的α-synuclein表達(dá)免疫熒光檢測結(jié)果顯示，正常組SH-SY5Y細(xì)胞α-synuclein的熒光強(qiáng)度較弱(圖4A)，在模型建立之后，模型組的α-synuclein的熒光強(qiáng)度(圖4B)明顯增強(qiáng)，表明魚藤酮促進(jìn)了該蛋白的表達(dá)，而加入瘦素組(圖4C)其熒光強(qiáng)度又有所下降，表明瘦素降低了魚藤酮引起的α-synuclein的表達(dá)。

5 瘦素預(yù)處理后Bcl-2、Bax和GSK-3β磷酸化表達(dá)變化 Western blot結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)SHSY5Y細(xì)胞的魚藤酮濃度的增加，Bcl-2和p-GSK-3β(Ser9)的表達(dá)顯著降低(圖5A)。0.5 μg/ml和2 μg/ml的瘦素對PD模型組(5 μmol/L魚藤酮誘導(dǎo))的Bcl-2和p-GSK-3β(Ser9)的表達(dá)顯著增加(圖5B)。其中圖5A和圖5B中第1組均為對照組，圖5B中第2組為模型組。

討 論

圖 3 瘦素預(yù)處理后對魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞存活率和死亡率的影響(aP＜0.05, vs 對照組； bP＜0.05, vs 魚藤酮模型組)Fig. 3 Effect of leptin pretreatment on viability and mortality of rotenone-induced SH-SY5Y cells (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs rotenone group)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種以黑質(zhì)紋狀體通路的退變?yōu)橹饕卣鞯纳窠?jīng)系統(tǒng)變性疾病。帕金森患者的大腦黑質(zhì)區(qū)有路易小體的出現(xiàn)，并伴隨多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性缺失[6]。治療帕金森病的經(jīng)典藥物是左旋多巴，但長期應(yīng)用后會導(dǎo)致惡心、低血壓、精神癥狀等不良反應(yīng)，對慢性帕金森病患者基本失去治療作用。鑒于此，很有必要探索其他藥物治療帕金森病[7]。

目前，人們對帕金森病發(fā)病機(jī)制仍未明確，但越來越多的研究表明選擇性多巴胺神經(jīng)元損傷和喪失與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)，出現(xiàn)帕金森病癥狀的患者其腦內(nèi)多巴胺能細(xì)胞80%以上發(fā)生凋亡[8]。Tang等[9]研究認(rèn)為各種病因可經(jīng)由細(xì)胞凋亡這一條共同路徑而導(dǎo)致帕金森病發(fā)病，凋亡是導(dǎo)致帕金森病神經(jīng)元變性的基礎(chǔ)。魚藤酮可以直接通過血腦屏障抑制腦組織的線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的活性，而多巴胺神經(jīng)元又對能量障礙特別敏感，因此低劑量的魚藤酮在不影響其他部位線粒體功能的情況下，可引起多巴胺神經(jīng)元的凋亡[2]。

瘦素是一種潛在的神經(jīng)保護(hù)因子，在神經(jīng)退行性疾病中有著一定的治療作用[10-11]，能防止黑質(zhì)細(xì)胞損傷，對小鼠帕金森病的發(fā)病有一定的預(yù)防和治療作用[12]?？沟蛲龅鞍譈cl-2可與促凋亡蛋白Bax拮抗，抑制細(xì)胞色素C自線粒體釋放至胞質(zhì)，進(jìn)而抑制凋亡，Bcl-2和Bax比值(Bcl-2/Bax)能提示是否發(fā)生凋亡[13]。在帕金森病研究模型中，GSK-3β活性增高，誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元凋亡，而GSK-3β活性被抑制時，α-突觸核蛋白表達(dá)降低，神經(jīng)元的凋亡降低，神經(jīng)元得到保護(hù)，其中p-GSK-3β(Ser9)是GSK-3β的活性抑制形式[14-16]。

在本研究中，魚藤酮能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞存活率，提高死亡率，抑制了Bcl-2的表達(dá)和GSK-3β的磷酸化，促進(jìn)了Bax的表達(dá)。模型建立后，通過瘦素的干預(yù)，探索了瘦素在帕金森病中的神經(jīng)保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)顯示與模型組相比，瘦素的干預(yù)抑制了SH-SY5Y細(xì)胞的死亡，提高了存活率，對細(xì)胞的狀態(tài)有了一定的改善，α-synuclein的熒光強(qiáng)度有所下降，p-GSK-3β(Ser9)和Bcl-2的水平顯著增加，上調(diào)了Bcl-2/Bax，降低了GSK-3β的活性。因此瘦素使p-GSK-3β(Ser9)的水平顯著增加，抑制其活性，進(jìn)而促進(jìn)了Bcl-2/Bax的比值，并降低了α-synuclein的表達(dá)，這可能是瘦素保護(hù)的基礎(chǔ)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了瘦素可能對帕金森病有一定的治療作用，為臨床用于帕金森病防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，瘦素對于帕金森病中神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制，還有待于進(jìn)一步深入研究。

圖 5 Western blot檢測瘦素預(yù)處理后Bcl-2、Bax和GSK-3β磷酸化表達(dá)變化Fig. 5 Expressions of Bcl-2, Bax and p-GSK-3βafter leptin pretreatment

1 Xie HR， Hu LS， Li GY. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line：in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease［J］ . Chin Med J， 2010， 123（8）： 1086-1092.

2 韓威，孫立忠，胡林森．魚藤酮與帕金森?。跩］.中國老年學(xué)雜志，2011，31（12）：2376-2378．

3 盧芳，周世慧，董楊，等．α-突觸核蛋白與帕金森?。跩］.哈爾濱醫(yī)藥，2011，31（4）：293-295．

4 陳妍， 白潔. 糖原合酶激酶-3β與帕金森病的發(fā)生及治療［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報， 2009， 25（12）： 1096-1101.

5 司藝玲，顏光濤．瘦素神經(jīng)保護(hù)作用的研究進(jìn)展［J］.感染、炎癥、修復(fù)，2009，10（1）：56-58．

6 徐杰，張國華，陶恩祥．利福平抑制α-synuclein的聚集及對MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的拮抗作用［J］.中國病理生理雜志，2006，22（10）：2032-2035．

7 徐鋆陽，王濤．利福平對魚藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y凋亡的抑制作用［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2008，37（3）：329-331．

8 Lu DY， Chen JH， Tan TW， et al. Resistin protects against 6-hydroxydopamine-induced cell death in dopaminergic-like MES23.5 cells［J］. J Cell Physiol， 2013， 228（3）： 563-571.

9 Tang XQ， Zhi JL， Cui Y， et al. Hydrogen peroxide preconditioning protects PC12 cells against apoptosis induced by dopamine［J］. Life Sci， 2005， 78（1）： 61-66.

10 Lu J， Park CS， Lee SK， et al. Leptin inhibits 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced cell death in SH-SY5Y cells［J］. Neurosci Lett， 2006， 407（3）： 240-243.

11 梁辰，鄧子輝，張金英，等．瘦素降低全反式維甲酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白過度磷酸化［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，34（5）：495-497．

12 Weng Z， Signore AP， Gao Y， et al. Leptin protects against 6-hydroxydopamine-induced dopaminergic cell death via mitogenactivated protein kinase signaling［J］. J Biol Chem， 2007， 282（47）：34479-34491.

13 王衛(wèi)東. Bcl-2/Bax比率與細(xì)胞“命運(yùn)”［J］. 中國腫瘤生物治療雜志， 2007， 14（4）：393-396.

14 Li Y， Luo F， Wei L， et al. Knockdown of glycogen synthase kinase 3 beta attenuates 6-hydroxydopamine-induced apoptosis in SH-SY5Y cells［J］. Neurosci Lett， 2011， 487（1）： 41-46.

15 Kaga S， Zhan L， Altaf E， et al. Glycogen synthase kinase-3beta/ beta-catenin promotes angiogenic and anti-apoptotic signaling through the induction of VEGF， Bcl-2 and survivin expression in rat ischemic preconditioned myocardium［J］. J Mol Cell Cardiol，2006， 40（1）：138-147.

16 Nagao M， Hayashi H. Glycogen synthase kinase-3beta is associated with Parkinson's disease［J］. Neurosci Lett， 2009， 449（2）：103-107.

Leptin alleviates rotenone-induced injury of SH-SY5Y cells

HAN Ming, ZHANG Jin-ying, SONG Cui-hong, LIANG Chen, FENG Jie, YAN Guang-tao
Biochemistry Laboratory, Institute of Basic Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China Corresponding author: YAN Guang-tao. Email: yan301@263.net

ObjectiveTo study the inhibitory effect of leptin on rotenone-induced apoptosis of human neuroblastoma SH-SY5Y cells. MethodsA SH-SY5Y cell injury model was induced by rotenone and intervened with leptin. Viability of SH-SY5Y cells was assayed by MTT, apoptosis of SH-SY5Y cells was detected with trypan blue staining, morphology of SH-SY5Y cells was observed under inverted microscope, expression levels of Bcl-2, Bax, p-GSK-3β(Ser9), GSK-3β and α-synuclein were measured by Western blot and immunofuorescence, respectively. ResultsThe rotenone-induced SH-SY5Y cell injury model was successfully established. The survival rate of SH-SY5Y cells was about 14% higher(P＜0.05), the apoptosis rate of SH-SY5Y cells was about 17% lower(P＜0.05), the α-synuclein expression level was signifcantly lower whereas Bcl-2 and p-GSK-3β expression was signifcantly higher after leptin intervention than before leptin intervention. ConclusionLeptin can signifcantly inhibit rotenoneinduced SH-SY5Y cell injury by up-regulating the Bcl-2/Bax ratio and down-regulating the expression of α-synuclein through the activity of GSK-3β.

rotenone; SH-SY5Y cells; leptin

R 34

A

2095-5227(2014)02-0170-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.02.021

2013-11-08 10:35

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20131108.1035.001.html

2013-07-30

科技基礎(chǔ)性工作專項項目(2011FY130100)；國家科技支撐計劃項目(2012BAK25B01)

Supported by National Basic Research Development Program of the Ministry of Science and Technology of China (2011FY130100); National Key Technology R&D Program(2012BAK25B01)

韓銘，男，在讀碩士。研究方向：神經(jīng)退行性疾病的治療。Email: hm299792458@126.com

顏光濤，男，副所長兼生化室主任，研究員，博士生導(dǎo)師。Email: yan301@263.net