趙 輝，劉丹平，齊 鑫，張解元，李 諶

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001

Adv-HIF-1αmu轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞對CXCL12表達(dá)影響的研究

趙 輝，劉丹平，齊 鑫，張解元，李 諶

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001

目的研究轉(zhuǎn)染低氧誘導(dǎo)因子1α突變型(hypoxia inducible factor 1αmu，HIF1αmu)后的外源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)中CXCL12的表達(dá)情況及對EPCs的影響。方法密度梯度離心結(jié)合差速貼壁法分離、培養(yǎng)EPCs并進(jìn)行鑒定；以Adv-HIF-1αmu的最佳轉(zhuǎn)染指數(shù)轉(zhuǎn)染EPCs，獲得含有目的基因處理的EPCs細(xì)胞，設(shè)為A組。B組為單純轉(zhuǎn)染Adv的EPCs。設(shè)未轉(zhuǎn)染Adv-HIF-1αmu的EPCs為C組。Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后的EPCs中HIF-1的表達(dá)，檢測轉(zhuǎn)染后的EPCs培養(yǎng)液上清液中的CXCL12濃度及其對外源性EPCs遷移的影響。結(jié)果密度梯度離心結(jié)合差速貼壁法獲得的EPCs能夠結(jié)合UEA-1和攝取ac-LDL，并具有成血管作用；轉(zhuǎn)染Adv-HIF-1αmu的EPCs表達(dá)的HIF-1及CXCL12高于單純轉(zhuǎn)染Adv的EPCs及未轉(zhuǎn)染Adv-HIF-1αmu的EPCs(P＜0.05)，且能誘導(dǎo)外源性EPCs的遷移。結(jié)論密度梯度離心結(jié)合差速貼壁法能夠分離、培養(yǎng)符合特征的EPCs，轉(zhuǎn)染Adv-HIF-1αmu的EPCs能夠在常氧條件下高表達(dá)HIF-1及CXCL12，并誘導(dǎo)外源性EPCs的遷移。

內(nèi)皮祖細(xì)胞；低氧誘導(dǎo)因子-1αmu；腺病毒；趨化因子CXCL12

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類來源于骨髓，存在于外周血循環(huán)中，在生長因子的作用下可分化為內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)的前體細(xì)胞[1-2]。低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor1，HIF1)是一種廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的在低氧條件下表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)血管再生和微血管形成，提高組織和細(xì)胞在缺血環(huán)境下的生存能力[3-5]。而HIF-1α被證明可以上調(diào)局部的趨化因子CXCL12[3]，通過CXCL12/ CXCR4生物學(xué)軸的作用促進(jìn)含有其受體CXCR4的EPCs的趨化及歸巢作用并增強(qiáng)改善缺血能力[6-7]。因此，若兩者能在缺血局部共同發(fā)揮作用，可以更好地促進(jìn)局部血管形成，改善缺血部位的血運(yùn)，促進(jìn)恢復(fù)。但HIF-1α在常氧環(huán)境中極易降解失活，而經(jīng)過PCR技術(shù)突變后在常氧環(huán)境中不被氧化且轉(zhuǎn)錄高表達(dá)活性[5]，記作HIF1αmu。利用這一思路，我們將成功構(gòu)建的能夠在常氧條件下表達(dá)的突變體Adv-HIF1αmu轉(zhuǎn)染EPCs，觀察轉(zhuǎn)染后EPCs內(nèi)的CXCL12表達(dá)情況。

材料和方法

1 主要材料 1周齡雄兔1只，體質(zhì)量310 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供、Adv-HIF1αmu由遼寧醫(yī)學(xué)院劉丹平等構(gòu)建。M199培養(yǎng)液(Hyclone)、表皮生長因子(英國PeproTech)、血管內(nèi)皮生長因子(英國PeproTech)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(英國PeproTech)、淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锕?、FITC標(biāo)記的荊豆凝集素(美國Sigma)、DiI標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(美國Vector)、人纖維連接蛋白(美國Chemicon)、HIF-1α單克隆抗體(美國NOVUS)等。

2 EPCs的體外分離培養(yǎng) 取兔四肢長骨，密度梯度離心法提取單個核細(xì)胞。DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶里培養(yǎng)48 h后首次換液，獲取未貼壁的細(xì)胞，然后重懸在M199培養(yǎng)基中。接種在預(yù)先包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中。3 d后首次換液，去除其中不貼壁細(xì)胞，后每隔3 ～4 d換液1次。

3 骨髓來源的EPCs鑒定 原代細(xì)胞傳代后，培養(yǎng)至第10天，取消化培養(yǎng)的細(xì)胞，離心后去上清，PBS漂洗2 min，2次；加入5 ml DIL-ac-LDL(10 μg/ml)，37℃孵育1 h；PBS漂洗2次；2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min；PBS漂洗2次；加入5 ml FITC-UEA-l (10 μg/ml)，37℃孵育1 h。用激光共聚焦顯微鏡觀察。DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是EPCs。

4 EPCs成血管能力檢測 以EPCs小管形成實(shí)驗(yàn)來檢測EPCs體外血管新生能力。據(jù)Matrigel的使用說明，檢測EPCs體外小管形成能力。細(xì)胞重排為毛細(xì)血管樣的結(jié)構(gòu)即定義為小管形成。以5 μg/ml的濃度加入鈣黃綠素染活細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察小管形成的長度，Image-Pro Plus計算機(jī)軟件進(jìn)行分析。

5 轉(zhuǎn)染EPCs 經(jīng)檢測Adv-HIF1αmu轉(zhuǎn)染EPCs的最佳轉(zhuǎn)染指數(shù)(multiple of infection，MOI)為150，以MOI=150轉(zhuǎn)染EPCs，獲得含有目的基因處理的EPCs細(xì)胞，設(shè)為A組。B組為單純轉(zhuǎn)染Adv的EPCs。設(shè)未轉(zhuǎn)染Adv-HIF1αmu的EPCs為C組(即空白組)。各組細(xì)胞培養(yǎng)10 d。

6 Western Blot檢測HIF-1的表達(dá) 培養(yǎng)第10天，各組按要求胰酶消化后取1×106個細(xì)胞，加入4℃裂解緩沖液中，冰上孵育30 min。4℃12 000 r/min離心5 min。取上清液加等倍SDS上樣緩沖液，沸水浴10 min，放于-20℃保存待用。常規(guī)灌膠，上樣，采用電轉(zhuǎn)儀裝置恒流200 mA，于4℃轉(zhuǎn)膜1 ～1.5 h。使用Tween-20 PBS稀釋一抗(羊抗兔單克隆抗體)，二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊IgG)與濾膜共溫浴，顯色。用凝膠成像系統(tǒng)分析膜上目的條帶和內(nèi)參照(β-actin)，測定吸光度(A)值。

7 ELISA檢測CXCL12表達(dá) 取A、B、C組細(xì)胞于2 d、4 d、8 d的培養(yǎng)液上清，按照ELISA試劑盒說明步驟進(jìn)行操作，檢測CXCL12濃度并繪制不同時間的濃度曲線，各組進(jìn)行比較。

8 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞懸液對外周EPCs的遷移的影響 用0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化貼壁的EPCs成單細(xì)胞懸液，以1×105/ml濃度的EPCs重懸于含1% FBS的M199培養(yǎng)基中，取100 μl加到上層小室中，小室下層分別加600 μl的A、B、C 3組的細(xì)胞懸液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。24 h后從培養(yǎng)箱中取出小室，甲醇固定5 min，Giemsa染液(原液1∶10稀釋)染色15 min，清水脫色后光鏡下觀察濾膜外側(cè)面的細(xì)胞。100倍隨機(jī)8個視野計數(shù)，取平均值。

9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以-±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

1 EPCs的分離培養(yǎng)及形態(tài)變化 EPCs于接種后48 h開始貼壁，可見有梭形或不規(guī)則三角形細(xì)胞貼附于培養(yǎng)皿底部。培養(yǎng)第4天換液后可見細(xì)胞集落形成，成漩渦狀排列。培養(yǎng)10 ～ 15 d可見EPCs呈“鵝卵石”樣特異性表現(xiàn)。見圖1。

2 骨髓來源EPCs的特征性鑒定 在激光共聚焦顯微鏡下，Dil標(biāo)記的ac-LDL為紅色熒光，而FITC標(biāo)記的UEA-1為綠色熒光，紅、綠熒光重疊雙染的細(xì)胞即為EPCs，見圖2。

3 EPCs的成血管能力檢測 在Matrigel上能夠形成血管樣結(jié)構(gòu)，見圖3。

4 Western Blot檢測HIF-1的表達(dá) A組HIF-1α蛋白表達(dá)明顯高于B組和C組(P＜0.05)(圖4)，其結(jié)果灰度值比較見表1。

5 ELISA檢測CXCL12的濃度變化 各組細(xì)胞培養(yǎng)液CXCL12濃度呈先上升后下降的趨勢，濃度高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)后第4天。轉(zhuǎn)染Adv-HIF1αmu的EPCs(A組)的CXCL12濃度明顯高于B組和C組，見圖5。

6 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞懸液對外周EPCs的遷移的影響轉(zhuǎn)染Adv-HIF1αmu后的EPCs上清液能趨化更多外周EPCs遷移。EPCs穿過濾膜數(shù)A組為61.3± 10.3，B組為32.5±11.5，C組為28.6±9.6(P＜0.05) (圖6)。

圖 1 EPCs鏡下特點(diǎn)(倒置相差顯微鏡×100) A: 培養(yǎng)4 d， 出現(xiàn)集落; B: 10 ～ 15 d， 可見鋪路石樣表現(xiàn)Fig. 1 Inverted microscopy showing colony (A) and pebbles (B) of EPCs 4 and 10-15 days after culture (×100)

圖 2 骨髓來源的EPCs鑒定A: FITC標(biāo)記的UEA-1(×200); B： Dil標(biāo)記的ac-LDL(×200)； C ： 紅、綠熒光重疊雙染(×200)Fig. 2 Identification of FITC-marked UEA-I (A), Dil-marked ac-LDL (B), red and green fuorescence-stained bone marrow-derived EPCs (C)(×200)

圖 3 EPCs在Matrigel上形成血管樣結(jié)構(gòu)Fig. 3 Formation of vascular structure in Matrigel of EPCs

圖 4 Western Blot檢測HIF-1α的表達(dá)Fig. 4 Western blot showing expression of HIF –1α

圖 5 ELISA檢測CXCL12表達(dá)2 d時A組CXCL12濃度(513±14) ng/L, 4 d的EPCs培養(yǎng)液上清中CXCL12濃度(1 414±72) ng/L， 8 d時的濃度為(1 055± 37) ng/L，明顯高于同時間B組及C組EPCs培養(yǎng)液上清中CXCL12濃度Fig. 5 ELISA revealing expression of CXCL12 The CXCL12 concentrations were significantly higher in the supernatant of group A (513±14) ng/L on day 2, and (1 414±72 ng/L) on day 4, (1 055±37) ng/L on day 8 , than in those of group B and group C

圖 6 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清液對外周EPCs的遷移的影響遷移數(shù)量A組明顯多于B組及C組(P＜0.05)，B組與C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)Fig. 6 Effect of transfected EPCs supernatant on migration of exogenous EPCs The number of migrated EPCs was significantly greater ingroup A than in groups B and C (P＜0.05) with no signifcantdifference found between group B and group C (P＞0.05)

表1 Western blot灰度值比值Tab. 1 Western blot showing gray value ratio of HIF-1α (-±s, n=5)

表1 Western blot灰度值比值Tab. 1 Western blot showing gray value ratio of HIF-1α (-±s, n=5)

aP＜0.05, vs group B and group C

GroupHIF-1α A 0.412±0.018aB 0.207±0.049 C 0.221±0.034

討 論

內(nèi)皮祖細(xì)胞是一類能夠定向分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在胚胎或成年后缺血、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下參與血管的新生[1,8]。自從1997年由日本研究者Asahara發(fā)現(xiàn)后，其作用越來越受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。低氧誘導(dǎo)因子-1α是在低氧環(huán)境中起細(xì)胞調(diào)控作用的關(guān)鍵基因，在缺血造成的低氧中發(fā)揮重要作用[2]。但是HIF-1α在常氧環(huán)境中極易降解失活[5]。為了使其能夠在低氧及常氧條件下均能表達(dá)，我們前期使用基因技術(shù)成功構(gòu)建了能夠在常氧條件下表達(dá)的突變體Adv-HIF1αmu[8]。

EPCs表面存在著一種趨化因子受體CXCR4，其配體為CXCL12[9-10]，這種配體可在EPCs[7]、基質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞及組織分泌，并在CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸的作用下促進(jìn)EPCs趨化、歸巢至缺血部位繼而發(fā)揮成血管作用而改善局部缺血情況[11-13]。既往的研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12在維持造血干細(xì)胞存活方面也起重要作用[14-15]。而HIF-1α被證明可以上調(diào)局部的CXCL12[5]，促進(jìn)EPCs的趨化及歸巢作用并增強(qiáng)改善缺血能力。利用這一思路，我們將成功構(gòu)建的能夠在常氧條件下表達(dá)的突變體Adv-HIF1αmu轉(zhuǎn)染EPCs，觀察轉(zhuǎn)染后EPCs內(nèi)的CXCL12表達(dá)情況。

本實(shí)驗(yàn)中，利用EPCs與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)貼壁時間差異[16]即EPCs在培養(yǎng)48 h后貼壁，而BMSCs通常在48 h內(nèi)貼壁，觀察細(xì)胞形態(tài)。并通過檢測其結(jié)合UEA-1和攝取ac-LDL的能力及成管能力檢測進(jìn)行細(xì)胞鑒定。以最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI=150轉(zhuǎn)染EPCs，10 d后Western Blot檢測HIF-1的表達(dá)，結(jié)果表明，A組(即轉(zhuǎn)染Adv-HIF1αmu)的EPCs能夠表達(dá)HIF-1，而B組(未轉(zhuǎn)染Adv-HIF1αmu的EPCs)和C組(單純轉(zhuǎn)染Adv的EPCs)未表達(dá)HIF-1。而ELISA結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Adv-HIF1αmu的EPCs中CXCL12的表達(dá)較其他兩組有明顯上調(diào)，未轉(zhuǎn)染Adv-HIF-1αmu的EPCs和單純轉(zhuǎn)染Adv的EPCs中CXCL12表達(dá)無明顯差異。通過對比3組細(xì)胞上清液對EPCs的趨化遷移作用，證實(shí)轉(zhuǎn)染Adv-HIF-1αmu的細(xì)胞可以促進(jìn)外周EPCs向其遷移。綜上所述，將Adv-HIF-1αmu轉(zhuǎn)染入EPCs后可以上調(diào)細(xì)胞CXCL12的表達(dá)并促進(jìn)外周EPCs的趨化遷移。

缺血性疾病，包括股骨頭壞死、心肌梗死、肢體缺血壞死等，是當(dāng)今世界的一大難題，而隨著干細(xì)胞移植技術(shù)的快速發(fā)展，讓人們看到了解決這一難題的希望。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，轉(zhuǎn)染Adv-HIF-1αmu的EPCs可以通過HIF-1的表達(dá)而上調(diào)局部CXCL12的表達(dá)，進(jìn)而通過CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸的作用誘導(dǎo)、趨化其他干/祖細(xì)胞歸巢至缺血部位，發(fā)揮各自的再生作用，進(jìn)而改善和逆轉(zhuǎn)缺血狀態(tài)。為治療缺血性疾病提供新的思路。

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Effect of Adv-HIF-1αmu-transfected endothelial prognostic cells on expression of CXCL12

ZHAO Hui, LIU Dan-ping, QI Xin, ZHANG Jie-yuan, LI Chen
First Affliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China

LIU Dan-ping. Email: liudanping2009@sohu.com

ObjectiveTo study the effect of HIF1αmu-tansfected exogenous endothelial progenitor cells (EPCs) on expression of CXCL12.MethodsEPCs were isolated, cultured and identifed by density gradient centrifugation in combination with differential velocity adherent technique. Adv-HIF- 1αmuwas transfected into EPCs with the optimum multiplicity of infection (MOI). EPCs containing the purpose gene served as group A, Adv-transfected EPCs served as group B, and non Adv-HIF-1αmu-transfected EPCs served group C. Expression of HIF-1 in transfected EPCs was detected by Western blot. Effect of CXCL12 concentration in transfected EPCs supernatant on migration of exogenous EPCs was assayed.ResultsThe EPCs isolated by density gradient centrifugation in combination with differential velocity adherent technique can bind to UEA-1 and uptake ac-LDL, and are thus angiogenic. The expression level of HIF-1 and CXCL12 in Adv-HIF-1αmu-transfected EPCs was signifcantly higher in group A than in groups B and C(P＜0.05) and can induce the migration of exogenous EPCs.ConclusionDensity gradient centrifugation in combination with differential velocity adherent technique can isolate and culture the characteristic EPCs. Adv-HIF-1αmu -transfected EPCs can highly express HIF-1 and CXCL12 and induce the migration of exogenous EPCs.

endothelial progenitor cells; hypoxia inducible factor 1αmu; adenovirus; CXCL12

R-322

A

2095-5227(2014)01-0085-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.01.027

時間：2013-09-29 10:55

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20130929.1055.006.html

2013-08-05

遼寧省衛(wèi)生廳“百千萬人才工程”資助課題(2010921045)

趙輝，男，在讀碩士。研究方向：骨組織工程。Email: 276056908@qq.com

劉丹平，男，博士，教授。Email: liudanping2009@sohu.com