聶玉林廖宏慶,周 靜,謝輝軍彭翠英**

1. 南華大學藥學與生命科學學院（衡陽 421001）;

2. 南華星輝生殖健康?？漆t(yī)院; 3. 南華大學附屬第二醫(yī)院

體外受精受精率與男方精子參數(shù)的關(guān)系*

聶玉林1,2廖宏慶2,3周 靜2,3謝輝軍1彭翠英1**

1. 南華大學藥學與生命科學學院（衡陽 421001）;

2. 南華星輝生殖健康?？漆t(yī)院; 3. 南華大學附屬第二醫(yī)院

目的探討體外受精（IVF）技術(shù)中精子處理前后常規(guī)參數(shù)與受精率的關(guān)系。方法 選擇2011年6月到2013年3月在南華星輝生殖健康?？漆t(yī)院行IVF助孕的285個鮮胚周期，將這285個周期分為受精率≤40%組（A組）和受精率＞40%組（B組），分別比較兩組處理前無A級精子比例、上游法回收率≤5%比例、處理后前向運動（PR）總數(shù)＜1.0×106比例、精子巴氏染色正常形態(tài)＜4%比例、精子頂體酶活性＜48.2μIU/106精子比例的差異。結(jié)果A、B兩組處理前無A級精子比例（分別為14.7% 和0.4%，P＜0.05）、上游法回收率≤5%比例（分別為23.5%和0.8%，P＜0.05）、處理后PR總數(shù)＜1.0×106比例（分別為17.6%和0%，P＜0.05）均具有顯著性差異（P＜0.05）；精子巴氏染色＜4%（分別為11.8%和10.0%）、頂體酶活性＜48.2 μIU /106精子（5.9%和2.4%）均無顯著性差異。結(jié)論處理前無A級精子、上游法回收率≤5%和處理后PR總數(shù)＜1.0×106是影響受精率的高危因素；精子巴氏染色＜4%和精子頂體酶活性低對預測IVF受精率具有一定局限性。

受精,體外; 頂體蛋白酶; 精子計數(shù)

目前體外受精方式分為傳統(tǒng)的常規(guī)體外受精（in vitrofertilization, IVF）和單精子卵細胞漿內(nèi)注射法（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）。IVF技術(shù)主要適應于女性輸卵管阻塞或損傷等原因造成的精子與卵細胞自然結(jié)合障礙，然而在目前的認識水平，IVF受精失敗還無法完全避免[1]。ICSI技術(shù)主要用于嚴重少、弱、畸精子癥以及梗阻性無精子癥患者，由于該技術(shù)受精率穩(wěn)定，大大地降低了受精失敗的發(fā)生率，使得該項技術(shù)的應用范圍逐漸擴大到包括臨界精液質(zhì)量、常規(guī)體外受精失敗、不明原因不孕及非男性因素不孕等眾多方面[1,2]。但是有學者統(tǒng)計，當精子功能無異常時，ICSI并不比傳統(tǒng)IVF更有優(yōu)勢[3]，同時ICSI技術(shù)和IVF相比較減少了對精子的自然的篩選，增加了對卵子和精子的有創(chuàng)性操作，引入了不可測因素[1]，給出生小孩的健康問題帶來擔憂[4]。短時受精，早期補救ICSI的應用使得因受精失敗而放棄移植的情況基本得到規(guī)避，同時也嚴格的控制了ICSI的指征[1]。但是補救ICSI增加了配子的操作次數(shù)和操作時間，而且早期受精狀態(tài)的評估容易出現(xiàn)判斷錯誤，導致3PN增加和未受精也未行補救ICSI[1]。對那些非嚴重少、弱、精癥患者，該如何在授精術(shù)前選擇合理的助孕方式，既能盡量采用創(chuàng)傷少的IVF授精方式，又能保證獲得的卵子形成更多優(yōu)質(zhì)胚胎，一直是輔助生殖研究的重點。盡管一些精子功能學檢測能夠超越常規(guī)精液分析成為IVF成功的預測指標，但其在鑒別診斷方面的優(yōu)勢并不明顯，還不足以與精液分析相結(jié)合成為常規(guī)操作[5]。本研究對我中心行IVF治療的患者進行回顧性分析，探討精子處理前后參數(shù)與低受精率的關(guān)系，從而預測精子受精能力。

對象與方法

一、研究對象

2011年6月至2013年3月，在南華星輝生殖健康?？漆t(yī)院行常規(guī)IVF助孕的285個周期，全部為促排卵周期，其中有9個周期行IVF+ICSI助孕，僅計算IVF部分的情況，所有周期均采用上游法處理精液。

二、主要試劑與耗材

精子培養(yǎng)液GIVF、人血清白蛋白HAS，購自瑞典Vitrolife公司；巴氏染色液（蘇木素、橙黃G6，EA50）、頂體酶試劑盒購自深圳華康醫(yī)學工程公司；15mL 錐形管2099和5ml 圓底管2003購自美國Falcon公司；1.5mL EP管（Eppendorf），購自德國艾本德公司。

三、實驗方法

（一）分組

首先將周期按受精率分組（受精率 =IVF受精卵數(shù)/IVF卵數(shù)×100%），受精率≤30%組（受精率低下[6]），30%～組，40%～組，50%～組，60%～組，70%～組，80%～組，90%～組，根據(jù)鮮胚臨床妊娠率（鮮胚臨床妊娠率=鮮胚臨床妊娠周期數(shù)/鮮胚移植周期數(shù)×100%）、無胚胎可移植率（無胚胎移植率=無可移植胚胎周期數(shù)/取卵周期數(shù)×100%）在40%上下具有統(tǒng)計學差異分為受精率≤40%組（A組，共34周期）和受精率＞40%組（B組，共251周期）。

（二）精子計數(shù)

精液檢查和處理參照2010年WHO第五版《人類精液檢查與處理實驗室手冊》[7]，操作人員均參加過WHO第五版的培訓；精子分級采用WHO第四版《人類精液及精子與宮頸粘液相互作用實驗室手冊》[8]，A級精子即快速前向運動，在37℃時速度＞25μm/s；B級精子，慢速的前向運動，速度為＞5μm/s，≤25μm/s；C級精子，原地轉(zhuǎn)圈，非前向運動，速度≤5μm/s，D級精子，完全不動。

（三）上游法處理精液

男方禁欲2～7d，取卵后1.5h安排患者排精，讓排出的精液液化20min，將1.0～2.0ml精液置于裝有2.0ml 90% GIVF（GIVF:HSA=9:1）的2099管底，45°傾斜在培養(yǎng)箱內(nèi)加熱模塊中，培養(yǎng)箱溫度為37.0℃，二氧化碳濃度為5%，上游40～50min，取上清液于另一管裝5ml 90%GIVF的2099管中混勻，500×g，離心5min，棄上清液，留0.1～0.5ml混勻，將優(yōu)選的精子混懸液轉(zhuǎn)移至2003管中，置于培養(yǎng)箱中平衡用于授精。

（四）取卵與IVF授精

注射人絨毛膜促性腺激素（HCG,Human Chorionic Gonadotropin）后（35±0.5）h取卵，將在體視顯微鏡下找到的卵丘復合體裝于2003管中，3～5個卵子/管，管中為90%的GIVF 1mL。擰松管蓋放在二氧化碳濃度為6%，溫度37.2℃恒定的培養(yǎng)箱中平衡。注射HCG后（39.5±0.5）h授精，先將1.0×105個精子加入裝有1ml 90%GIVF的2003管中，將卵子轉(zhuǎn)移至已加精子的2003管中，精卵混合（17±0.5）h后觀察原核形成情況[9,10]，（65±1）h后觀察胚胎情況[1,10]。

（五）精子巴氏染色

取精后30min計數(shù)，60min內(nèi)根據(jù)精子濃度取0.1～0.5mL精液于1.5mL EP管中，用生理鹽水清洗2遍，留0.5mL混勻制片，自然風干；根據(jù)WHO第五版《人類精液檢查與處理實驗室手冊》標準染色，使用配制好的巴氏染色液，按照嚴格的形態(tài)學標準評估精子形態(tài)[7]。

（六）精子頂體酶活性

取精后30min計數(shù)，根據(jù)精子濃度取出精子分裝于2個EP管，每管7.5×105個精子，一管為測試管，另一管為對照管。2000×g，離心20min，棄精漿，留沉淀，測試管與頂體酶試劑在24℃水浴箱中準確孵育60min，對照管加頂體酶試劑與終止反應液，2000 ×g，離心15min，取上清液在410nm波長下測吸光度值，頂體酶活性=（測試值-對照值）×105/（247.5× 7.5）μIU/106精子。

四、分析指標

上游法PR精子回收率[7]、處理后PR精子總數(shù)、無A級精子、精子巴氏染色、精子頂體酶活性，上游法回收率=（處理后體積×處理后濃度×處理后PR%）/（處理前體積×處理前濃度×處理前PR%）×100%；處理后PR總數(shù)=處理后體積×處理后濃度×PR% ；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/鮮胚移植周期數(shù)×100%；無胚胎移植率=無可移植胚胎人數(shù)/取卵周期數(shù)×100%

五、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，對上游法PR精子回收率≤5%比例、處理后PR精子總數(shù)＜1.0×106比例、無A級精子比例、精子巴氏染色＜4%比例、精子頂體酶活性＜48.2μIU /106精子比例，進行x2檢驗統(tǒng)計分析，對例數(shù)≤5的組項進行Fisher's Exact Test分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、不同受精率與臨床妊娠率和無胚胎移植率的關(guān)系

由表1可見，受精率低下[6]組（≤30%組）17例，占IVF總周期的6.0%；A組（受精率≤40%）共34周期，占IVF總周期的11.9%，B組（受精率＞40%組）共251周期，占88.1%。各受精率組男、女方平均年齡無明顯差異。鮮胚臨床妊娠率A組16.7%（3/18）明顯低于B組58.2%（107/184），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；無胚胎可移植率A組29.4%（10/34）明顯高于B組0.8%（2/251），差異也有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

二、兩組各項參數(shù)比較

A組與B組處理前后無A級精子比例、上游法回收率≤5%比例，PR總數(shù)＜1.0×106比例差異均有統(tǒng)計學（P＜0.05），巴氏染色＜4%比例和精子頂體酶低的比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 各組受精率與妊娠情況表

表2 A、B兩組常規(guī)參數(shù)比較

討 論

輔助生殖技術(shù)經(jīng)過20多年的發(fā)展，妊娠率在不斷提高，精液檢查也在不斷改進，尤其是WHO第五版對精液檢查和處理的質(zhì)量控制（QC）和質(zhì)量保證（QA）做了詳細的講解[7]，使得精液檢查的精確性和準確性都得到提高。但是常規(guī)分析畢竟不能檢測精子使卵子受精的潛能，也不能評估獲得受精能力必需的成熟過程[11]。雖然一些精子功能學檢測（如透明帶穿透試驗、精子DNA損傷檢測、活性氧評估等）在預測精子受精潛能方面甚至超過常規(guī)精液分析，但是鑒于目前的檢測方法還處于研究性階段，可操作性不強或結(jié)果還存在爭議[12]，因此對于一些處于臨界狀態(tài)的精子以及目前無法確定的功能異常精液，仍然影響著合理的助孕方式的選擇。本中心通過回顧性的分析受精率低下與IVF處理前后的一些參數(shù)的關(guān)系，對精子受精能力做出一定的預測，從而為體外受精方式提供參考。

在受精率≤40%組中處理前無A級精子顯著高于對照組，并且所有的無A級精子，其受精率均低于40%。這與Verheyen等[13]發(fā)現(xiàn)用沒有或者很少A級活動精子的精液進行常規(guī)IVF受精失敗的風險很高是相符的。Bj?rndahil[14]認為精子活動力差可能有生殖道及生殖器官的某些疾病導致。精囊液中的精子活動力、存活率下降時同時伴有精子染色體保護水平下降，精子DNA碎片增加，有研究表明精子前向運動活動力與DNA碎片呈負相關(guān)，而精子DNA完整性破壞將導致精子受精能力顯著下降[15]。精子尾部線粒體是精子的動力源，精子9+2微管是精子的動力臂，當精子線粒體活性不足或者功能障礙以及精子9+2微管存在缺陷，精子表現(xiàn)前向運動活力不足，而這些缺陷可能與某些基因突變有關(guān)，這種精子很可能造成IVF完全受精失敗[16]。

由表2可見10周期上游法回收率≤5%的精子中有8周期出現(xiàn)受精率≤40%，但是仍有2周期受精率大于40%，原因可能是實驗室進行IVF精液處理時，對精子濃度、活力都很好的精子并未追求最大回收率所致。上游法處理精子利用精子游動來篩選出活力良好的精子，操作簡便，而且不會影響精子的生物學特征，有研究表明上游法處理后的精子較處理前正常形態(tài)精子比例增加，精子DNA碎片率降低[17]。由于精子必需克服重力來向上游，因此上游法PR精子回收率要低于密度梯度離心法。對于一些精液，當盡最大可能回收PR精子仍不能達到5%回收率，這種精子可能存在某種功能缺陷、快速前向運動精子比例不足或者患者精子對精子培養(yǎng)液中某些成分敏感，因此精子上游能力弱。

A組處理后PR精子總數(shù)＜1.0×106比例顯著高于B組。雖然在ICSI發(fā)明前，當卵子充足的情況下，正常運動精子濃度＜1.0×106夫婦仍有47%的機會獲得有胚胎，但是妊娠結(jié)局遠低于對照組[18]。處理后PR精子總數(shù)與排出精液體積，精子濃度，活動力，存活率以及回收率相關(guān)。當患者排精充分，精液收集完全，尤其男方多年原發(fā)不育，精子存在功能異常的概率較大。有研究認為少、弱、畸精子癥常常同時伴有精子功能缺陷。

由于樣本量有限，雖然A組精子巴氏染色＜4%比例略高于B組，但并無顯著差異，這與舒金春等通過精子形態(tài)來預測精子IVF受精能力具有局限性相符[18]。WHO第五版對于精子形態(tài)作了嚴格的標準，但精子形態(tài)正常并不一定意味著功能正常，精子正常形態(tài)率低不一定不能受精[18,19]而且WHO對精液參數(shù)的修訂并未收集占據(jù)世界人口1/5的中國男性精子[18]。一些文獻報道畸形精子對受精的影響，需要更加注重畸形的部位和畸形的程度[20]，尤其是一些遺傳性決定的精子缺陷如圓頭精子癥、巨大頭精子癥、精子纖維鞘發(fā)育不良、原發(fā)性纖毛不動綜合征等；而對于那些非遺傳性精子形態(tài)異常（如錐形頭、梨形頭），經(jīng)IVF受精仍能取得較好的結(jié)局[5]。同時上游法優(yōu)選精子技術(shù)，能夠回收出活動力強的精子，并且提高了正常形態(tài)精子的比例，有助于取得良好的受精及妊娠結(jié)局。

本研究對頂體酶活性＜48.2μIU/106精子的精液進行分析，A組高于B組，差異不具有統(tǒng)計學意義。WHO第五版對精子頂體酶活性檢測，目前定為研究性檢測，尚需要更大量的樣本驗證。精子頂體酶是由透明質(zhì)酸酶、頂體蛋白酶、B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶、芳基神經(jīng)酰胺酶、膠原酶樣多肽酶、磷脂酶等30多種酶組成的酶系[1,21]，而酶的反應具有高度專一性，頂體酶檢查究竟是檢查其中的哪一種或哪一類酶，目前的試劑盒并未標注，所以頂體酶活性高并不能代表精子頂體功能一定正常；同時頂體酶檢查是針對750萬個精子（包含活精子和死精子）的頂體酶總活性，并不能完全說明部分具有受精能力的精子的頂體功能。由于我們中心頂體酶活性低行IVF的樣本數(shù)不夠，其結(jié)論還有待進一步探討。

綜上所述，處理前無A級精子、上游法PR精子回收率≤5%和處理后PR精子總數(shù)＜1.0×106這3點是導致IVF受精率≤40%的高危因素，但是對于這種精子的存在哪些功能缺陷，還需要收集更多的樣本，做進一步分析。對畸精子癥還需要考慮畸形的部位和畸形的程度以及處理后的正常形態(tài)精子總數(shù)，頂體酶活性測定還需要更多樣本以及方法學的驗證，單獨分析處理前畸精子癥，以及目前試劑盒測定的頂體酶活性結(jié)果對預測IVF受精率具有一定局限性。

1 黃國寧, 孫海翔主編. 體外受精-胚胎移植實驗室技術(shù).北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2012: 163-182

2 劉平, 任秀蓮. 非男性因素的ICSI與IVF受精方式選擇.生殖醫(yī)學通訊 2012; 6(2): 14-15

3 Bhattacharya S, Hamilton MP, Shaaban M,et al. Conventional in-vitro fertilization versus intracytoplasmic sperm injection for the treatment of non-male-factor fertility: a randomized controlled trial.Lancet2001; 357(9274): 2075-2079

4 Zhu JL, Basso O, Obel C,et al. Infertility, infertility treatment, and congenital malformations: Danish national birth cohort.BMJ2006; 333(7570): 679

5 Ford WC. Comments on the Release of the 5th edition of the WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human semen.Asian J Androl2010; 12(1): 59-63

6 方小武, 吳日然, 徐建亞, 等. 常規(guī)IVF受精失敗或受精率低下相關(guān)因素分析. 中國優(yōu)生與遺傳雜志 2012; 20(7): 112-113

7 World Health Organization. Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen.5th ed. geneva: World Health Organization, 2010; 7-124

8 World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interactions.4th ed.Cambridge University Press,1999: 5-20

9 Depa-Martynow M, Jedrzejczak P, Pawelczyk L. Pronuclear scoring as a predictor of embryo quality in vitro fertilization program.Folia Histochem Cytobiol2007; 45 Suppl 1: S85-S89

10 Tesarik J, Greeo E. The probability of abnormal preimplantation development can Predieted by a single static observation on pronuclear stage morphology.Hum Reprod1999; 14(5): 1318-1323

11 Pacey AA. Quality assurance and quality control in the laboratory andrology.Asian J Androl2010; 12(1): 21-25

12 Lamb DJ. Semen analysis in 21st century medicine: the need for sperm function testing.Asian J Androl2010; 12(1): 64-70

13 Verheyen G, Tournaye H, Staessen C,et al. Controlled comparison of conventional in-vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection in pationts with asthenozoospermia.Hum Reprod1999; 14(9): 2313-2319

15 Bj?rndahl L, Kvist U. Sequence of ejaculation affects the spermatozoon as a carrier and its message.Reprod Biomed Online2003; 7(4): 440-448

16 Harton GL, Tempest HG. Chromosomal disorders and male infertility.Asian J of Androl2012; 14(1): 32-39

17 黃茜, 丘映, 史秋雯, 等. 兩種處理方法對精子頂體完整性和DNA損傷的影響. 中國熱帶醫(yī)學 2013; 13(3): 340-342

18 Menkveld R. Clinical significance of the low normal sperm morphology value as proposed in the f fth edition of the WHO Laboratory Manual for the Examination and processing of Human Semen.Asian J Androl2010; 12(1): 47-58

19 舒金輝, 馮貴雪, 李勁, 等. 按WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版標準探討精子形態(tài)對IVF-ET助孕結(jié)局的預測價值. 中華男科學雜志 2013; 19(5): 414-417

20 Auger J. Assessing human sperm morphology: top models, underdogs or biometrics?Asian J Androl2010; 12(1): 36-46

21 郭睿. 男性生殖基礎與實驗室研究. 軍事醫(yī)學科學出版社, 2009; 71-72

（2013-12-12收稿）

The relationship between male sperm parameters and the fertilization rate of IVF*

Nie Yulin1,2, Liao Hongqing2,3, Zhou Jing2,3, Xie Huijun1, Peng Cuiying1**
1. Pharmaceutical and Life Sciences, University of South China, Hengyang 421001, China;
2. Nanhua Xinghui Reproductive Health Hospital; 3. The second aff liated hospital of South China university

Peng Cuiying, E-mail:pengcy0613@aliyun.com; Tel: 0734-8281224

ObjectiveTo study the relationship between the general parameters of sperm and the fertilization rate of IVF.MethodsA total of 285 IVF cycles were collected from Nanhua Xinghui Reproductive Health Hospital from June 2011 to March 2013. The 285 cycles were divided into group A (the fertilization rate of IVF ≤40%) andgroup B (the fertilization rate of IVF >40%). The percentage of without A grade sperm before preparation, the percentage of the recovery of sperm swim-up≤5%, the percentage of the total PR sperm after preparation <1.0×106, the percentage of normal sperm morphology of papanicolaous stain<4% and sperm acrosin activity<48.2MIU/106were analyzed respectively.ResultsBetween the two groups there were signif cant difference in the percentage of without A grade sperm before preparation (14.7% VS. 0.4%,P<0.05), the percentage of the recovery of sperm swim-up≤5%(23.5% VS.0.8%,P<0.05), the percentage of the total PR after preparation<1.0×106(17.6% VS.0%,P<0.05) , and there were not signif cant changes in the percentage of normal sperm morphology of papanicolaous stain<4% (11.8% VS.10.0%), the percentage of sperm acrosin activity <48.2 MIU/106(5.9% VS.2.4%).ConclusionWithout A grade sperm before preparation, the recovery of sperm swim-up≤5% and the total PR after preparation <1.0×106were signif cantly associated with the fertility rate of IVF. Whereas, sperm morphology of papanicolaous stain and sperm acrosin activity showed some limition in predicting the fertility rate of IVF.

fertilizationin vitro; acrosin; sperm count

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.007

R 321-33

*資金項目資助: 湖南省科技計劃項目（2012FJ4296）; 國家自然科學基金（31371277）**

, E-mail:pengcy0613@aliyun.com; Tel: 0734-8281224