郭 華，張曉娟，張 潔，呂 磊，趙仙先

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秋水仙堿對煙草側(cè)流煙霧導(dǎo)致的大鼠主動脈氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能不全的保護作用

郭 華1，張曉娟2，張 潔1，呂 磊1，趙仙先3*

（1南京軍區(qū)南京總醫(yī)院干部心臟內(nèi)科，南京 210002；2解放軍第81醫(yī)院血透室，南京 210002；3第二軍醫(yī)大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院：長海醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200001）

探討秋水仙堿對大鼠主動脈氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能的影響。制備吸入煙草側(cè)流煙霧的大鼠模型，同時通過管飼法給大鼠服用秋水仙堿。56d實驗結(jié)束后，測定大鼠主動脈中超氧化物歧化酶（SOD）活力，丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）含量，以及進行內(nèi)皮依賴的主動脈舒張實驗，觀察秋水仙堿對煙草煙霧導(dǎo)致的大鼠主動脈氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能改變的影響。與對照組相比，吸入煙草側(cè)流煙霧大鼠組中MDA含量明顯升高，NO、eNOS含量以及SOD活力下降，主動脈舒張功能受損，而服用秋水仙堿的大鼠可明顯改善這些異常改變（＜0.05）。（1）吸入煙草側(cè)流煙霧可引起大鼠主動脈內(nèi)皮氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能不全；（2）經(jīng)秋水仙堿治療后，可改善大鼠主動脈內(nèi)皮氧化應(yīng)激和受損的內(nèi)皮功能。

秋水仙堿；煙草側(cè)流煙霧；主動脈；氧化應(yīng)激；內(nèi)皮功能

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病等疾病的基礎(chǔ)，研究顯示其本質(zhì)上是一種慢性炎癥性疾病[1]。藥物治療仍是此類疾病治療的基石。而在藥物綜合治療中，缺乏針對動脈硬化的“抗炎”藥物。秋水仙堿因其獨特的抗炎作用越來越被重視。研究已證實，長期吸煙主要通過誘發(fā)血管炎性微環(huán)境的改變，引起氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能不全，從而導(dǎo)致動脈硬化的發(fā)生發(fā)展[2]。因此，本研究旨在探討秋水仙堿對因煙草側(cè)流煙霧暴露，從而引起的大鼠主動脈氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能不全的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

30只健康Sprague-Dawley（SD）大鼠，約8周齡，體質(zhì)量（body mass，BM）200～250g（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實驗動物中心），隨機分成3組，每組10只，正常對照組（control，C），煙草側(cè)流煙霧暴露組（sidestream cigarette smoke，SSCS，S），煙草側(cè)流煙霧暴露加秋水仙堿干預(yù)組（SSCS and colchicine treatment，SC）。3組大鼠嚴格按照《江蘇省實驗動物照顧和使用規(guī)定》，飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠內(nèi)，飼養(yǎng)室溫控制在20～24℃，按照正常生物光照循環(huán)，專人提供食物和飲水，打掃籠內(nèi)衛(wèi)生。

1.2 方法

1.2.1 SSCS暴露及秋水仙堿給藥途徑 按林邦和等[3]的方法自制兩個SSCS染毒箱（100cm×60cm×40cm）放置對照組和實驗組。實驗用煙為常見的商品煙（大豐收，焦油含量13mg/支，尼古丁含量1mg/支，安徽煙草公司）。S組和SC組大鼠被放置入染毒箱內(nèi)，每次在3h內(nèi)自然燃燒10根香煙，每天進行兩次暴露實驗，同時SC組大鼠通過管飼法，給予秋水仙堿[0.1mg/（kg·d）]，56d后活殺大鼠，進行實驗研究。正常對照組大鼠放置在另一個染毒箱內(nèi)，暴露于正?？諝猓渌┞稐l件與其他兩組大鼠完全相同，56d后進行對照研究。

1.2.2 血流動力學(xué)指標(biāo)的測量 在活殺大鼠之前，測量各組大鼠血壓、心率及BM；取5次結(jié)果的平均值作為實驗結(jié)果。

1.2.3 血清中生化指標(biāo)的檢測 56d實驗結(jié)束后，取大鼠下腔靜脈血清樣本，在我院檢驗中心進行分析檢測，檢測指標(biāo)包括紅細胞（red blood cells，RBC）、白細胞（white blood cells，WBC）、血小板（platelets，PLT）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）等。

1.2.4 離體主動脈環(huán)內(nèi)皮依賴的主動脈舒張實驗 煙草暴露以及秋水仙堿藥物干預(yù)實驗結(jié)束后，將各組大鼠麻醉，以快速斷頭術(shù)活殺大鼠，迅速取出約4cm長的胸主動脈，取2cm于液氮中凍存用于測量丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、一氧化氮（nitric oxide，NO）以及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）相關(guān)指標(biāo)，另剩余的主動脈用于內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的測定。將上述大鼠胸主動脈放入4℃并持續(xù)通以95%O2＋5%CO2混合氣體的Krebs緩沖液（mmol/L，NaCl 118，KCl 4.75，NaHCO325，MgSO41.2，CaCl22，KH2PO41.2，葡萄糖11；pH＝7.4）中，切割成長約3mm的血管環(huán)并放入含Krebs緩沖液器官浴槽中，在維持37℃的條件下并持續(xù)通以95%O2＋5%CO2混合氣體，一端固定，一端通過張力換能器連接PowerLab數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)。調(diào)節(jié)血管環(huán)的基礎(chǔ)最佳張力至1.8g，并平衡60min，期間每15min換液1次。預(yù)先通過去甲腎上腺素（1μmol/L）收縮主動脈，待其收縮張力達到最大限度后，依次加入不同濃度的乙酰膽堿（10-8～10-4mol/L），記錄每一濃度下主動脈環(huán)的舒張程度（以舒張百分比計量），并繪制劑量反應(yīng)曲線[4,5]。

1.2.5 主動脈SOD活性、MDA和NO含量測定 SOD活性利用試劑盒（南京建成生物工程研究所）通過黃嘌呤氧化酶法測量，MDA含量的測定利用試劑盒（南京建成生物工程研究所）通過苯巴比妥反應(yīng)物法測量。利用NO試劑盒（南京碧云天生物公司）測量NOx（亞硝酸鹽NO2?與硝酸鹽NO3?之和）來代表體內(nèi)NO水平。嚴格按照試劑盒說明書進行試驗操作研究，SOD活性和MDA、NO含量最終通過比色法分別在550nm和532nm、540nm處測定。

1.2.6 eNOS含量測定 采用Western印跡法測定eNOS表達水平。取胸主動脈組織用冷TBS洗滌2～3次，置于勻漿器，加RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法進行蛋白定量。樣品加適當(dāng)體積×5蛋白上樣緩沖液煮沸5min、冷卻，離心后取上清，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE凝膠制備調(diào)劑盒，武漢谷歌生物科技有限公司），電泳后轉(zhuǎn)膜，室溫下將轉(zhuǎn)膜置于脫色搖床上，用5%的脫脂牛奶封閉1h，加入一抗eNOS（稀釋度1∶2000，美國Anbo Bio公司），4℃過夜；TBST漂洗3次，5min/次；加二抗（稀釋度1∶3000，美國Anbo Bio公司），室溫30min后，用TBST在室溫下脫色搖床上，洗3次，每次5min。將A和B兩種試劑在離心管中等體積混合，將膜蛋白面朝上與此混合液充分接觸，1～2min后，去盡殘液，包好，放入X片夾中曝光。將膠片進行掃描存檔，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血流動力學(xué)變化

經(jīng)過8周的SSCS的暴露，S組大鼠的血壓明顯高于C組（＜0.05），而經(jīng)過秋水仙堿的干預(yù)后，其升高的血壓降低，但SC組和C組大鼠之間血壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義。相對于C組，其他兩組的大鼠心率明顯增快（＜0.05），且S和SC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。SC組大鼠BM低于其他兩組大鼠（＜0.05；表1）。

表1 各組大鼠血壓、心率和體質(zhì)量的變化

Group C: control group; Group S: sidestream cigarette smoke group; Group SC: sidestream cigarette smoke and colchicine treatment group; BP: blood pressure; HR: heart rate; BM: body mass. Compared with group C,P＜0.05; compared with group S,P＜0.05

2.2 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)變化

56d實驗結(jié)束后，取大鼠靜脈血行相關(guān)血液理化指標(biāo)檢查。在各組大鼠之間相關(guān)血液理化指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05；表2）。

表2 各組大鼠理化指標(biāo)變化

Group C: control group; Group S: sidestream cigarette smoke group; Group SC: sidestream cigarette smoke and colchicine treatment group; RBC: red blood cells; WBC: white blood cells; Hb: hemoglobin; PLT: platelets; ALT: alanine aminotransferase; SCr: serum creatinine

2.3 各組大鼠乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的變化

與C組相比，S組的大鼠胸主動脈環(huán)對乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)明顯受損，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；給予秋水仙堿干預(yù)56d后，SC組大鼠受損的舒張功能有一定程度的改善（＜0.05），但相對于C組，并不能完全修復(fù)其舒張功能（＜0.05；圖1）。

圖1 各組大鼠主動脈內(nèi)皮依賴舒張反應(yīng)的比較

Figure 1 The change in endothelium-mediated vascular relaxation of aorta in three groups Continuous variables present as mean ± SD. Group C: control group;Group S: sidestream cigarette smoke group; Group SC: sidestreamcigarette smoke and colchicine treatment group; Compared with group C,*＜0.05; compared with group S,#＜0.05

2.4 各組大鼠SOD活力、MDA和NO含量比較

S組大鼠主動脈MDA含量明顯高于C組，而SOD活力和NOx的含量低于C組（＜0.05），給予秋水仙堿治療8周后，SC組大鼠主動脈升高的MDA和降低的SOD、NOx有所恢復(fù)，但與C組相比，差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義，不能完全將其恢復(fù)至C組水平（＜0.05；表3）。

表3 各組大鼠主動脈SOD活力、MDA和NO含量表

Group C: control group; Group S: sidestream cigarette smoke group; Group SC: sidestream cigarette smoke and colchicine treatment group; SOD: superoxide dismutase; MDA: malondialdehyde; NO: nitric oxide. Compared with group C,*＜0.05; compared with group S,#＜0.05

2.5 各組大鼠主動脈中eNOS蛋白表達的變化

在采用Western印跡法測試大鼠主動脈eNOS蛋白表達的研究中，其規(guī)律類似于NOx，S組大鼠主動脈eNOS蛋白表達最低，依次為SC、C組（＜0.05；圖2）。

3 討 論

秋水仙堿是一種“古老”的藥物，目前主要用于治療家族性地中海熱（familial Mediterranean fever，F(xiàn)MF）以及其他結(jié)晶性關(guān)節(jié)炎。近年研究提示它對動脈粥樣硬化性疾病有一定的治療作用。Nidorf等[4]在給已經(jīng)服用阿司匹林和阿托伐他汀的穩(wěn)定性心絞s痛患者長期口服秋水仙堿，可進一步降低高敏C反應(yīng)蛋白的水平；在其隨后的小劑量秋水仙堿（LoDoCo）研究中給患者每日增加0.5mg秋水仙堿，在隨訪中期就發(fā)現(xiàn)可明顯降低急性冠脈綜合征的發(fā)生率[5]；Crittenden等[6]研究發(fā)現(xiàn)，給患有痛風(fēng)的冠心病患者長期服用秋水仙堿可降低其心肌梗死的發(fā)生率。還有一些研究發(fā)現(xiàn)秋水仙堿治療的FMF、痛風(fēng)患者其平均血小板體積明顯減少[7]，也從側(cè)面提示秋水仙堿對冠心病的治療有積極意義。這些臨床研究給冠心病的綜合治療帶來曙光，部分學(xué)者探討將其運用到冠心病二級預(yù)防中的可能性。雖然目前對其具體的作用機制尚不明確，但大部分學(xué)者認為其特有的抗炎作用具有決定性的意義[8]。這些理論上的推測缺乏具體的動物實驗以及實驗室數(shù)據(jù)支持。氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能不全是動脈粥樣硬化性疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，因此本研究嘗試探索秋水仙堿對因煙草煙霧導(dǎo)致的大鼠主動脈氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能不全的影響。

圖2 各組大鼠主動脈中eNOS蛋白表達的比較

Figure 2 The expression of eNOS protein in the aorta of three groups Continuous variables present as mean±SD. Group C: control group;Group S: sidestream cigarette smoke group; Group SC: sidestreamcigarette smoke and colchicine treatment group; eNOS : endothelialnitric oxide synthase. Compared with group C,*＜0.05; compared with group S,#＜0.05

研究已證實，氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能不全對血管動脈硬化性疾病的發(fā)展起重要的推動作用。

氧化應(yīng)激主要是表現(xiàn)為MDA升高和SOD下降，而內(nèi)皮功能不全體現(xiàn)在eNOS/NO途徑異常[9]。在本研究中，與C組比較，S組大鼠主動脈MDA含量明顯增加，NO含量減低，SOD、eNOS活性明顯下降，與文獻報道[10]一致。SC組大鼠主動脈MDA、NO含量和SOD、eNOS活性介于C組和S組大鼠之間。提示秋水仙堿可在一定程度上改善煙草煙霧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激以及內(nèi)皮功能不全。動脈粥樣硬化性疾病本質(zhì)上是一種慢性炎癥性疾病。動脈炎性微環(huán)境改變后（煙草煙霧暴露），使促炎因子、炎性因子分泌增加并活化，引起炎性細胞、血小板聚集，誘發(fā)趨化效應(yīng)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能不全，最終發(fā)生血管粥樣硬化性疾病[11]。而秋水仙堿作為細胞骨架和微管蛋白解聚劑，具有廣泛的抗炎、抗增生、抗纖維化、微管解聚功能。因此筆者考慮秋水仙堿可能是限制了促炎及炎性因子的活性，進而緩和了炎性微環(huán)境的改變，從而改善煙草煙霧暴露引起的動脈變化。但是煙草含有大量的自由基以及其他成分，炎性微環(huán)境變化并不是其引起血管損害的唯一途徑[12]，因此秋水仙堿并不能完全糾正氧化應(yīng)激以及受損的內(nèi)皮功能。這仍需進一步的研究證實。

秋水仙堿是一種細胞毒藥物[13]，但在一定的劑量范圍內(nèi)，是可以安全并長期服用的。在其他的動物實驗研究中，秋水仙堿并沒有明確定義的劑量范圍，筆者選用相對安全的劑量進行研究[14][0.1mg/（kg·d）]。在56d的藥物治療過程中，SC組大鼠的體質(zhì)量低于其他兩組，同時部分大鼠伴有脫毛和排稀便的表現(xiàn)，應(yīng)該與秋水仙堿常見的消化道副作用（可引起腹瀉以及吸收障礙）[13]相關(guān)。但相關(guān)血清指標(biāo)檢查中3組未有明顯差異。在臨床實際工作中，任何小的副作用都會影響藥物的使用。因此在以后的研究工作中，秋水仙堿的減毒效應(yīng)也是研究的重點。

綜上所述，秋水仙堿在一定程度上可改善因煙草煙霧暴露而誘發(fā)的大鼠主動脈氧化應(yīng)激以及內(nèi)皮功能不全，可能與其獨特的抗炎作用有關(guān)。這個結(jié)果提示秋水仙堿有可能成為動脈粥樣硬化性疾病的藥物綜合治療有益補充，進一步改善其預(yù)后[15]。

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（編輯: 李菁竹）

Protective effect of colchicine on aortic oxidative stress and endothelial dysfunction in rats exposed to sidestream cigarette smoke

GUO Hua1, ZHANG Xiao-Juan2, ZHANG Jie1, LYU Lei1, ZHAO Xian-Xian3*

(1Department of Geriatric Cardiology, Nanjing General Hospital, Nanjing Military Command Nanjing 210002, China; ;2Dialysis Center, Chinese PLA Hospital No.81, Nanjing 210002, China;3Department of Cardiology, Changhai Hospital, Shanghai 200001, China)

To investigate the effect of colchincine on the aortic oxidative stress and endothelial dysfunction induced by exposure to sidestream cigarette smoke (SSCS).The rat model was made by SSCS for 56 consecutive days, and the rats of the intervention group were given colchicine by intragastric injection at the same time. The rats with no smoking exposure and intervention served as normal controls. At the end of treatment, the activity of superoxide dismutase (SOD), and the contents of malondialdehyde (MDA), nitric oxide (NO) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in the rat aorta were measured. The endothelium-dependent dilation (EDD) test was carried out on the rat aorta. The effect of colchincine on the aortic oxidative stress and endothelial dysfunction was observed.Compared with the normal controls, the SSCS model group had significantly increased content of MDA, obviously decreased activity of SOD, and remarkably reduced formation of NO and eNOS, and obviously impaired endothelium-mediated vascular relaxation of aorta. All these phenomena would be attenuated after 56 days’ colchicine treatment.Exposure to SSCS induces aortic oxidative stress and endothelial dysfunction in rats. These deleterious effects can be abated by colchicine treatment.

colchicine; sidestream cigarette smoke; aorta; oxidative stress; endothelial function

R979.1; R322.12

A

10.3724/SP.J.1264.2014.000215

2014?09?14;

2014?10?26

趙仙先, E-mail: 13601713431@163.com