張 濤 陳 斌呂逸清 王鴻祥 胡 凱 金 炎楊 昊 馮 坦 黃燕平 韓銀發(fā) 王益鑫 黃翼然

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科, 上海市男科學(xué)研究所（上海 200001）

白細(xì)胞精液癥治療前后精漿瘦素與精液常規(guī)、精子凋亡率的檢測及相關(guān)性分析*

張 濤 陳 斌**呂逸清 王鴻祥 胡 凱 金 炎楊 昊 馮 坦 黃燕平 韓銀發(fā) 王益鑫 黃翼然

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科, 上海市男科學(xué)研究所（上海 200001）

目的探索白細(xì)胞精液癥患者治療前后精液常規(guī)、精漿瘦素（Leptin）及精子凋亡率與正常人群的差異，并分析其相關(guān)性。 方法 隨機(jī)選取2010年10月至2012年5月本院泌尿男科門診的白細(xì)胞精液癥患者80例（WBC組），另選取生育力及各項精液參數(shù)均正常的生育人群標(biāo)本40份作為對照組，在患者治療前及經(jīng)治療精液白細(xì)胞水平恢復(fù)正常后，采用計算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）行精液常規(guī)檢測、放射免疫法檢測精漿Leptin、Annexin V+PI染色-流式計數(shù)法測定精子凋亡率。比較各參數(shù)的組間差異并分析其相關(guān)性。 結(jié)果 WBC組治療前精子濃度及活力均低于對照組（P＜0.05，P＜0.01），精子凋亡率顯著高于對照組（P＜0.01），精漿Leptin水平高于對照組（P＜0.05），精漿Leptin水平與精子凋亡率之間存在正相關(guān)性（r=0.678，P＜0.05），經(jīng)治療后精子活力顯著增加（P＜0.01），凋亡率降低（P＜0.05），精漿Leptin水平亦明顯下降（P＜0.05）。 結(jié)論 治療前白細(xì)胞精液癥患者精子濃度、活力下降，而精漿Leptin水平和凋亡率均有增加，精漿Leptin與精子凋亡率之間存在正相關(guān)性。治療后精漿Leptin與精子凋亡率均出現(xiàn)下調(diào)，精液常規(guī)各項參數(shù)明顯改善，提示Leptin可能參與了過量白細(xì)胞誘發(fā)精子細(xì)胞凋亡的途徑。

白細(xì)胞精液癥; 瘦素; 精子; 細(xì)胞凋亡

白細(xì)胞精液癥是導(dǎo)致男性不育的重要病因之一，常由感染、自身免疫性疾病、吸煙、酗酒以及精索損傷等因素引起，其最常見的原因是生殖道感染，如前列腺炎、精囊腺炎、附睪炎、睪丸炎等。 Leptin是由肥胖基因編碼的蛋白質(zhì)類激素，對機(jī)體的能量代謝，免疫功能和炎癥反應(yīng)等生理活動具有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，不少研究還表明Leptin在下丘腦、垂體前葉、睪丸及精子等與男性生育密切相關(guān)的器官、組織和細(xì)胞中廣泛存在，對生精功能及精子凋亡等生理過程具有重要調(diào)節(jié)作用[1-4]。但關(guān)于白細(xì)胞精液癥患者精子凋亡率與Leptin間的關(guān)系等問題仍有待進(jìn)一步深入了解。本研究通過比較白細(xì)胞精液癥患者在抗炎治療前后精液常規(guī)、精漿中Leptin的含量及精子凋亡率與正常組的差異，并分析其相關(guān)性，旨在對上述問題進(jìn)行進(jìn)一步探索。

材料與方法

一、研究對象

從2010年10月至2012年5月至本院泌尿男科就診的男性不育患者中隨機(jī)選取經(jīng)過氧化物酶染色法明確診斷的白細(xì)胞精液癥患者80例，在抗炎治療前及口服藥物治療至精液中白細(xì)胞＜1×109/L后行各項檢查（精液常規(guī)、精漿Leptin水平及精子凋亡率）。另選取年齡為22～38歲、無遺傳及生殖系統(tǒng)疾病、性生活及精液各項參數(shù)均正常，并成功使女方懷孕的正常生育力男性的40份精液標(biāo)本作為對照組。 實驗組入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡為21～41歲男性。（2）性生活正常，未采取任何避孕措施2年以上未使女方懷孕，女方生育能力檢查正常。（3）體檢未發(fā)現(xiàn)明顯睪丸、附睪及輸精管異常。（4）無外傷及遺傳性疾病家族史，無性功能障礙病史。（6）經(jīng)過氧化物酶染色確診精液中白細(xì)胞濃度＞1×109/L，（6）患者同意參加本次研究，依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）惡性腫瘤患者正接受放療、化療者。（2）其他致男性不育因素，如成人雙側(cè)隱睪、精索靜脈曲張、染色體異常等。（3）患有急性疾病，嚴(yán)重慢性疾病。

二、實驗方法

（一）精液標(biāo)本收集

所有研究對象在留取精液前均禁欲2～7d，于本院取精室按標(biāo)準(zhǔn)步驟留取精液標(biāo)本：排尿后洗凈雙手和陰莖，以手淫法將精液完整收集于專用的廣口容器中。精液標(biāo)本取出后立即放置于37℃水浴箱內(nèi)，待精液充分液化后行精液常規(guī)分析。精液經(jīng)3000g/min離心15min后分離出精漿、精子分別存于-80℃冰箱待統(tǒng)一檢測。白細(xì)胞精液癥組患者在精液中白細(xì)胞轉(zhuǎn)陰后3個月分別再次按上述步驟留取標(biāo)本，并同樣處理保存。

（二）精液常規(guī)分析

精液標(biāo)本經(jīng)37℃水浴充分液化后，由專門檢驗人員按照《世界衛(wèi)生組織人類精液及精子—宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊（第四版）》標(biāo)準(zhǔn)，先在顯微鏡下目測分析，然后使用精液分析系統(tǒng)進(jìn)行計算機(jī)輔助精液分析。每份標(biāo)本檢測均經(jīng)兩位檢驗員核校。

（三）Annexin V+PI法測定精子凋亡率

離心后新鮮的精子重新混懸于Annexin V/PI凋亡檢測專用的Buffer液中；用Makler板計數(shù)后將密度調(diào)節(jié)為（10～20）×105/ mL，取上述細(xì)胞液100μL，加入5μL Annexin V及1μL PI試劑，室溫下避光孵育15min，用流式細(xì)胞儀測定染色情況，激發(fā)波長為488nm，綠色熒光（480～530nm）采用FL1通道檢測，紅色熒光（575～630nm）采用FL2通道檢測。將“AN+/PI-”群精子判定為早期凋亡精子；“AN+/ PI+”群精子判定為晚期凋亡精子；“AN-/PI+”群精子判定為壞死精子；“AN-/PI-”群精子判定為非壞死或凋亡精子。計算晚期期凋亡精子數(shù)占總精子數(shù)的比例。

（四）放射免疫法檢測精漿Leptin

選用北京福瑞生物工程公司Leptin放射免疫測定試劑盒，按試劑盒說明進(jìn)行操作，用上海核所日環(huán)光電儀器有限公司全自動放射免疫γ計數(shù)器 讀數(shù)，使用SN695B型γ放射免疫計數(shù)測量系統(tǒng)（第二版）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣品濃度。

結(jié) 果

一、一般情況

WBC組患者年齡（27.23±8.53）歲，不育年限（3.68±1.53）年；對照組年齡（28.75±6.65）歲。WBC組與對照組在年齡、身高、體質(zhì)、體質(zhì)量指數(shù)方面均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

二、各組精液常規(guī)、精子凋亡率及Leptin檢測結(jié)果

各組精液常規(guī)、精子凋亡率及Leptin檢測結(jié)果見表1，采用Mann-Whitney Test分析比較任意兩組間差異。各組間精液pH無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。WBC患者術(shù)前精子濃度、活力及活動率均低于對照組，精子凋亡率及精漿Leptin水平高于對照組，經(jīng)治療至精液中白細(xì)胞恢復(fù)正常后，精子濃度、活力及活率較治療前有上升，精子凋亡率及Leptin水平亦明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而WBC組治療后的精子凋亡率高于對照組，差異具統(tǒng)計學(xué)意義，而精液參數(shù)及Leptin水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 WBC患者手術(shù)治療前后與對照組精液常規(guī)與精子凋亡檢測結(jié)果比較

圖1 WBC組治療前后與對照組精子凋亡率檢測圖

三、各組精子凋亡率檢測結(jié)果

精子凋亡率檢測結(jié)果如圖1所示。WBC組治療前精子凋亡率高于治療后及對照組（P＜0.05，P＜0.01）。

四、精漿Leptin與精子凋亡率的相關(guān)性分析

采用Spearman等級相關(guān)法分析精漿Leptin與精子凋亡之間的相關(guān)性，結(jié)果如下：

WBC組：精漿Leptin水平與精子凋亡率之間存在正相關(guān)性，（r=0.678，P＜0.05）。

對照組：精漿Leptin水平與精子凋亡率之間無顯著相關(guān)性，（r=0.368，P＞0.05），見表2，圖2。

表2 精漿Leptin與精子凋亡率相關(guān)性分析

討 論

白細(xì)胞精液癥是導(dǎo)致男性不育的主要原因之一，在男性不育中約占10%～20%。其病因是多方面的：感染、自身免疫性疾病、吸煙、酗酒、精索損傷等均可導(dǎo)致精液中出現(xiàn)過量白細(xì)胞，而泌尿生殖系統(tǒng)感染和免疫功能異常是白細(xì)胞精液癥的最常見病因[5]。大量研究表明：在白細(xì)胞精液癥患者中，作為第一道防御機(jī)制的中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞可通過吞噬作用、分泌炎性因子、刺激生殖道局部產(chǎn)生抗精子抗體及產(chǎn)生大量ROS等多種途徑導(dǎo)致精子質(zhì)量、存活率和活力的下降，從而導(dǎo)致男性不育[5-7]。因此，對精液中自細(xì)胞的檢出有廣泛的臨床參考價值。

圖2 精漿Leptin與精子凋亡率的相關(guān)性示意圖

Leptin是體內(nèi)廣泛存在的一種蛋白類激素，主要由白色脂肪組織細(xì)胞產(chǎn)生，對機(jī)體能量代謝、青春期的啟動、血管生成、免疫功能和炎癥反應(yīng)等生理過程均有一定的調(diào)節(jié)作用。在對細(xì)胞凋亡調(diào)控方面，目前已明確誘發(fā)脂肪細(xì)胞凋亡是Leptin參與調(diào)節(jié)體質(zhì)量的重要方式之一。后期的研究進(jìn)一步表明，Leptin促凋亡的功能不僅限于脂肪細(xì)胞，更可通過不同途徑誘導(dǎo)多種細(xì)胞的凋亡：如通過與受體結(jié)合[8]或促進(jìn)一氧化氮（Nitric oxide，NO）及氧自由基的生成，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[9]；通過抑制DNA合成，促進(jìn)垂體瘤細(xì)胞的凋亡[10]；通過上調(diào)前列腺素E2來促進(jìn)腎小管細(xì)胞的凋亡等[11]。近年來，Leptin在生殖系統(tǒng)及生精過程中的所發(fā)揮的作用日益受到人們的重視。已有研究發(fā)現(xiàn)少、弱精子癥患者的精漿Leptin水平高于精液參數(shù)正常男性，且Leptin在睪丸中的表達(dá)與精子生成障礙有關(guān)[12,13]；還有研究表明精漿中Leptin水平與精子活力及快速前向運動精子比例呈負(fù)相關(guān)[14,15]。我們前期對VC患者及動物模型的研究中也有類似結(jié)果[16,17]。在Leptin與精子細(xì)胞凋亡方面，有文獻(xiàn)報道內(nèi)分泌紊亂及Leptin自身表達(dá)異?？杉せ頲aspase依賴的生精細(xì)胞凋亡通路[18,19]，我們在研究中還發(fā)現(xiàn)在睪丸生精功能受損患者精漿Leptin及精子凋亡率均明顯增高的同時，精漿活性氧水平及與精子凋亡密切相關(guān)的Omi/HtrA2蛋白也顯著增高，提示Leptin參與了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的精子凋亡信號通路，而其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

本研究的結(jié)果證實白細(xì)胞精液癥患者精漿Leptin水平與精子凋亡密切相關(guān)。臨床上一般通過抗感染、抗氧化等方法治療白細(xì)胞精液癥。我們的研究還發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞精液癥患者經(jīng)治療白細(xì)胞恢復(fù)正常后患者精漿Leptin與精子凋亡率均出現(xiàn)下調(diào)且精液常規(guī)各項參數(shù)出現(xiàn)了明顯的改善。以上結(jié)果提示Leptin參與了精漿中過量白細(xì)胞誘導(dǎo)精子凋亡的病理過程。關(guān)于白細(xì)胞精液癥患者中Leptin參與精子凋亡的相關(guān)信號通路的具體機(jī)制及相互關(guān)系，以及干預(yù)Leptin參與的精子凋亡信號通路在輔助生殖中對提高受孕率、妊娠率及胚胎質(zhì)量是否有所幫助，將是值得關(guān)注和進(jìn)一步深入研究的課題。

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（2013-08-28收稿）

Test and correlation analysis of seminal Leptin, sperm parameters and apoptosis in leukocytospermia patients*

Zhang Tao, Chen Bin**, Lv Yiqing, Wang Hongxiang, Hu Kai, Jin Yan, Yang Hao, Feng Tan, Huang Yanping, Han Yingfa, Wang Yixin, Huang Yiran Department of Urology, Shanghai Institute of Andrology, Ren Ji Hospital, School of Medicine Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200001, China

Chen Bin, E-mail: binchen@263.sina.com

ObjectiveTo detect the seminal Leptin level, sperm parameters and sperm apoptosis rate of leukocytospermia patients before and after treatment, and explore their correlation.MethodsTotal of 80 leukocytospermia patients(WBC group)were randomly recruited in the study and their sperm samples were collected before and after treatment. Other 40 normal sperm samples were collected as the controls. The sperm parameters were detected by computer assisted sperm analysis (CASA). The level of semen plasma Leptin was measured by RIA and the sperm apoptosis rate were assessed by AnnexinV/PI staining-FACS.ResultsSperm concentration and viability in WBC group before treatment were all obviously lower than those of the control (P<0.05,P<0.01), whereas the apoptosis rate was signif cantly higher(P<0.01). The level of semen plasma Leptin was higher than that of the control (P<0.05), moreover itwas positively correlated withsperm apoptosis rate (r=0.678，P<0.05). After treatment, semen activity was increased and sperm apoptosis rate and Leptin level were decreased in WBC group. Conclusion Increase inseminal Leptin level and sperm apoptosis rate were founded in WBC group, which may be contributed to the decrease of sperm concentration and viability. Positive relationship between seminal Leptin and sperm apoptosis was found, implyingthat Leptin might play a role in sperm apoptosis by increasing seminal leukocyte.

leukocytospermia; leptin; spermatozoa; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.009

R 698.2

資助: 國家自然科學(xué)基金資助（課題編號：81270741）; 上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點學(xué)科群建設(shè)項目（PWZxkq2010-03）
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, E-mail: binchen@263.sina.com