陳洋

（惠州市職業(yè)病防治院，廣東 惠州 516008）

改良法秋水仙素處理技術(shù)在染色體畸變分析實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的比較性研究

陳洋

（惠州市職業(yè)病防治院，廣東 惠州 516008）

目的在染色體畸變分析實(shí)驗(yàn)中，探討與常規(guī)方法相比較改良法秋水仙素處理技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值。方法采取30份樣本，每份標(biāo)本分成兩份，分別采用A方法(常規(guī)法)和B方法（改良法）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和秋水仙素處理。然后均給予細(xì)胞收集、離心、固定、制片和染色等步驟。鏡檢計(jì)算每種方法的有絲分裂指數(shù)。然后利用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析（P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。結(jié)果兩種方法處理后的細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，分裂指數(shù)高，均能夠滿足分析要求。兩種方法所得有絲分裂指數(shù)比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論改良法秋水仙素處理技術(shù)具有秋水仙素用量少，毒性低，可控性好等優(yōu)勢(shì)，且實(shí)驗(yàn)效果可靠，具有推廣價(jià)值。

改良秋水仙素處理技術(shù)；染色體畸變分析

染色體畸變分析是放射工作人員健康監(jiān)護(hù)和慢性小劑量受眾遠(yuǎn)期醫(yī)學(xué)效應(yīng)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo),是最直接反映輻射損傷的檢查項(xiàng)目之一[1,2]。秋水仙素處理是染色體分析實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵步驟，常規(guī)方法是在細(xì)胞培養(yǎng)后加入秋水仙素處理，然后再行收獲、制片和染色[3,4]。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)長(zhǎng)期的細(xì)胞遺傳學(xué)工作經(jīng)驗(yàn)，改良了秋水仙素處理的方法，采取細(xì)胞培養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行秋水仙素處理，并取得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。現(xiàn)對(duì)該實(shí)驗(yàn)方法做如下分析。

表1 30份樣本經(jīng)兩種方法（A常規(guī)法/B改良法）秋水仙素處理后有絲分裂指數(shù)比較表(%)

1 材料與方法

1.1 材料

共采取30份樣本（均為肝素抗凝外周全血10 mL）、RPMI1640培養(yǎng)基、秋水仙素（20 μg/mL）、低滲液（為0.075 mol/L氯化鉀）、磷酸鹽緩沖液（由濃度均為1/15 mol/L的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀以1∶1體積比混合，pH值為6.8）。

1.2 方法

1.2.1 每個(gè)樣本分成兩份，分別采用A方法和B方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和秋水仙素處理。A方法（常規(guī)法）秋水仙處理：用5 mL注射器取血0.3 mL，接種到淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)50～54 h后，加入秋水仙素工作液處理3 h（終濃度為0.07 μg/mL）。B方法（改良法）秋水仙處理：用5 mL注射器取血0.3 mL，接種到己融化好的培養(yǎng)基中，同時(shí)加入秋水仙素工作液（終濃度為0.03 μg/mL），將培養(yǎng)基混勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)50～54 h。

1.2.2 首先收集細(xì)胞，將培養(yǎng)基倒入10 mL離心管中，1000 rpm/min離心6 min。棄上清液，加入低滲液8 mL，用滴管輕打混勻，于溫箱中靜置15 min。預(yù)固定：加入固定液1 mL，輕輕混勻。以1000 rpm/min離心6 min。固定：棄上清液，加入固定液8 mL混勻，靜置20 min，然后以1000 rpm/min，離心6 min。再次固定，棄上清液，加入6 mL固定液，靜置20 min，然后以1000 rpm/min，離心6 min。棄上清后，依細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液，約0.2 mL，備用。

1.2.3 制片：取細(xì)胞懸液滴在備用的濕冷玻片上，在酒精燈上過火，寫上編號(hào)。

1.2.4 Giemsa染色：Giemsa染液與磷酸緩沖液制成5%的工作液，把晾干的載玻片反蓋在上面（細(xì)胞面朝下），將制備好的工作液灌滿染色槽，排出氣泡，染色20 min后用自來水沖片，氣干。

1.2.5 鏡檢：在低倍鏡下尋找分散良好，長(zhǎng)短適中的分裂相，換用油鏡對(duì)其進(jìn)行細(xì)致觀察，每張片計(jì)數(shù)200個(gè)分裂相。計(jì)算每種方法的有絲分裂指數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量數(shù)據(jù)，自身配對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)（P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。

2 結(jié) 果

2.1 制片后鏡下觀察細(xì)：鏡下觀察，兩種方法處理后的細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，分裂指數(shù)高，能夠滿足分析要求，染色體分散均勻，著色良好，長(zhǎng)短適中，兩條姐妹染色體大致平行分離，著絲粒清晰。根據(jù)每條染色體的大小和著絲粒的位置，可區(qū)分中央著絲粒染色體、亞中央著絲粒染色體和近端著絲粒染色體。如下是制備完成的分散良好的染色體圖片（圖1和圖2）。

圖1 A常規(guī)法制片染色后光鏡下所見

圖2 B改良法制片染色后光鏡下所見

2.2 30份樣本經(jīng)兩種方法（A常規(guī)法/B改良法）秋水仙素處理后有絲分裂指數(shù)比較表，見表1。經(jīng)SPSS 17.0 軟件計(jì)算后結(jié)果，見表2和表3。

表2 成對(duì)樣本統(tǒng)計(jì)量

表3 成對(duì)樣本檢驗(yàn)

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算，P＞0.05，可見兩種方法所得有絲分裂指數(shù)比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討 論

總所周知，常規(guī)法秋水仙素處理已經(jīng)在染色體畸變研究中得到廣泛的使用，其可靠性毋庸置疑[5]。但由于該方法實(shí)驗(yàn)過程中需要多時(shí)間點(diǎn)監(jiān)控，所以各實(shí)驗(yàn)室在開展該項(xiàng)技術(shù)的初期，經(jīng)常會(huì)花費(fèi)較多時(shí)間去摸索實(shí)驗(yàn)條件，故學(xué)習(xí)曲線較長(zhǎng)，不利于實(shí)驗(yàn)技術(shù)的推廣。我們實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)積累，總結(jié)出改良法秋水仙素處理技術(shù)，實(shí)踐證明效果很好，通過上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，我們可以看出，兩種方法在實(shí)驗(yàn)結(jié)果方面并沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也就是說利用改良法秋水仙素處理可以得到和常規(guī)方法相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在實(shí)踐過程中，我們也可以看到，改良法具有以下幾方面的優(yōu)勢(shì)：①減少秋水仙素的用量和濃度，可以減少秋水仙素的毒性所致的細(xì)胞毒作用。秋水仙素使用：我們將秋水仙素于接種時(shí)即與標(biāo)本混合，我們認(rèn)為這樣的好處首先是接觸充分，利于秋水仙素的作用；其次，由于秋水仙素具有細(xì)胞毒性，高濃度其鏡下表現(xiàn)在可見細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)固縮，著色深紫色，細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低[6]，培養(yǎng)前混入秋水仙素，可減少秋水仙素的濃度（建議終濃度為0.03 μg/mL）和用量，即減輕其細(xì)胞毒作用，是提高實(shí)驗(yàn)效能的關(guān)鍵。②操作簡(jiǎn)便，單時(shí)間點(diǎn)控制，便于學(xué)習(xí)，利于推廣。實(shí)驗(yàn)方法上我們可以看到常規(guī)方法需要控制兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，即培養(yǎng)結(jié)束加入秋水仙素的時(shí)間點(diǎn)和秋水仙素作用時(shí)間點(diǎn)，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均須嚴(yán)格把控，稍有失誤，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。而改良法，只需掌握一個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，即培養(yǎng)結(jié)束時(shí)間，且由于秋水仙素濃度較低，即便時(shí)間稍有延長(zhǎng)（＜2 h），也不會(huì)影響制片效果，也不會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。所以改良法更利于學(xué)習(xí)，利于技術(shù)的推廣。

綜上所述，改良法秋水仙素處理技術(shù)便于學(xué)習(xí)，利于推廣，且效果良好，值得推廣。

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[2] 王喜愛,韓林,王平,等.放射工作人員外周血淋巴細(xì)胞微核分析 [J].醫(yī)藥論壇雜志,2008,29(4):32.

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Comparative Analysis of Improved Colchicines Application Method in Chromosome Aberrations Experiment

CHEN Yang

(Huizhou Occupational Disease Prevention Hospital, Huizhou 516008, China)

ObjectiveTo investigate the value of improved colchicines application method in chromosome aberrations experiment,compared with the conventional method.MethodsTo take 30 samples, each sample was divided into two parts, which were cultured and dealed with Method A (conventional method) and Method B (improved method of). The matured cells, which were collected and centrifuged, with discarding the supernatant, were fixed、dyed and observated at low magnification. The mitotic index were calculated.Then t-test was used with SPSS 17.0 for statistical analysis (P＜0.05 means that there are significant differences).ResultThe cells were cultured well in two ways, with high mitotic index, which were able to meet the analytical requirements. The results means that there were no significant difference (P＞0.05).ConclusionImproved colchicines application method had the advantages of less use dosage of colchicines, less toxicity, better controllability, and reliable experimental results, which had promotional value.

Improved colchicines application method; Chromosome aberrations

R-33

B

1671-8194（2014）16-0063-02