祁麗婷 李中青 趙晉峰 李齊霞 李顏芳 王瑞 孫萬(wàn)榮 王敏 王楓葉

摘要 [目的] 明確山西主要玉米品系的主要遺傳多樣性特點(diǎn)。 [方法]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)供試的玉米種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。[結(jié)果]用篩選出的9個(gè)多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物對(duì)供試種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出清晰條帶74條，多態(tài)性條帶56條，多態(tài)性條帶比率為75.7%。應(yīng)用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖，在遺傳相似系數(shù)為0.55處，將供試種質(zhì)材料分為5個(gè)類(lèi)群。[結(jié)論] 為今后山西玉米育種與雜交親本的選擇提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 ISSR;玉米;遺傳多樣性;聚類(lèi)分析

中圖分類(lèi)號(hào) S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2014）34-12046-02

Genetic Diversity of Maize Accessions Using Intersimple Sequence Repeat （ISSR） Markers

QI Liting，LI Zhongqing， ZHAO Jinfeng et al

（Millet Research Institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Changzhi， Shanxi 046011）

Abstract [Objective] The aim was to clear main genetic diversity characteristics of main corn strain ?in Shanxi. [Method]Using ISSR molecular markers to analyze the genetic diversity of maize germplasm resources. [Result] Nine primer of high polymorphism and good repeatability were used to amplify the germplasm material on the test. 74 bands were amplified， including 56 polymorphism bands. The percentage of polymorphism bands was 75.7%. Application of DPS software clustering analysis was carried out on the experimental results， and built the cluster analysis tree. The test germplasm materials were divided into five groups at the genetic similarity coefficient of 0.55. [Conclusion] The study provided theoretical reference for the selection of hybrid parent and maize breeding in the future.

Key words ISSR;Maize;Genetic diversity;Cluster analysis

玉米是現(xiàn)代食品、飼料、醫(yī)藥及化工的重要原料作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位。山西省玉米種植面積達(dá)160萬(wàn)hm2，已取代小麥成為山西省的第一大糧食作物。生態(tài)適應(yīng)性分析表明，玉米是山西最適宜種植的作物，在山西具有明顯的區(qū)域優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，由于分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，不僅可以在分子水平上了解育種材料的遺傳變異信息，有針對(duì)性地選擇雜交親本，在后代中獲得優(yōu)良變異，從而培育出優(yōu)良品種，同時(shí)了解這些品種的遺傳多樣性，對(duì)于指導(dǎo)親本選配和培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種具有重要意義。

筆者擬采用最為廣泛應(yīng)用的ISSR分子標(biāo)記技術(shù)[1]，對(duì)山西生產(chǎn)區(qū)域內(nèi)主要自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確山西主要玉米品系的主要遺傳多樣性特點(diǎn)，為今后山西玉米育種與雜交親本的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料均由山西省農(nóng)科院谷子研究所早熟課題組提供（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米總DNA提取。 將供試材料播種在裝有沙子的營(yíng)養(yǎng)缽中，在溫室（25 ℃左右）內(nèi)培養(yǎng)。每個(gè)材料種10株左右，待幼苗長(zhǎng)至3～4葉，葉片長(zhǎng)度為10 cm左右時(shí)剪去葉片，采用通用的CTAB方法提取總DNA，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 反應(yīng)程序。

①反應(yīng)體系（20 μl）：2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μl，10×buffer 2.0 μl，2 μmol/L 引物2 μl，5 U/μl Taq酶 0.2 μl，DNA 模板 3.0 μl，ddH2O 11.2 μl，另加mineral oil密封，在PCR板中進(jìn)行。

②PCR 反應(yīng)程序：94 ℃變性7 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，45 個(gè)循環(huán);72 ℃后延伸7 min，4 ℃保存。

③電泳檢測(cè)：擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。 PCR產(chǎn)物中加入 6×loading buffer 4 μl，混勻后點(diǎn)樣于孔中，接通電源后，電泳儀電壓調(diào)至120 V進(jìn)行電泳。

④電泳結(jié)束后，將電泳結(jié)果在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察、照相、保存。

表1 供試試驗(yàn)材料

編號(hào)自交系名稱(chēng)編號(hào)自交系名稱(chēng)編號(hào)自交系名稱(chēng)

1C19015C20629Mo17

2C19116C20930鄭58

3C19217C21231H51

4C19318C21332H391

5C19419C21433先玉128M

6C19520C21634冀海57

7C19621C21735478

8C19822C21936M2

9C19923C22137K12

10C20024C22038先玉508M

11C20225C22239先父

12C20326C223409903

13C20427C224

14C20528昌7-2

1.3 ?數(shù)據(jù)處理與分析

人工讀取條帶，采用1/0記錄方式。相同遷移率位置上有條帶的記為1，無(wú)條帶的記為0，建立數(shù)據(jù)矩陣。用DPS 6.05分析軟件中UPGMA對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析并繪制親緣關(guān)系樹(shù)狀聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴(kuò)增多態(tài)性

從52對(duì)引物中篩選出9條條帶清晰、穩(wěn)定且無(wú)拖尾的引物（表2）。用篩選出的引物對(duì)供試自交系材料進(jìn)行擴(kuò)增（圖1、2），共擴(kuò)增出清晰條帶74條，多態(tài)性條帶56條，多態(tài)性條帶比率為75.7%，表明供試自交系材料擴(kuò)增出的片段具有較高的多態(tài)性。

表2 ISSR引物序列及其擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性比較

引物名稱(chēng)引物序列總帶數(shù)多態(tài)條帶多態(tài)性比例∥%

ISSR 8075′AGAGAGAGAGAGAGAGT3′9.07.077.78

ISSR 8085′AGAGAGAGAGAGAGAGC3′8.06.075.00

ISSR 8105′GAGAGAGAGAGAGAGAT3′10.09.090.00

ISSR 8115′GAGAGAGAGAGAGAGAC3′10.08.080.00

ISSR 8155′CTCTCTCTCTCTCTCTG3′7.04.057.14

ISSR 8175′CACACACACACACACAA3′8.06.075.00

ISSR 8185′CACACACACACACACAG3′7.05.071.43

DISSR 8255′ACACACACACACACACT3′9.05.055.56

ISSR 8275′ACACACACACACACACG3′8.06.075.00

ISSR 8645′ATGATGATGATGATGATG3′7.05.071.43

總數(shù)83.061.0

平均8.36.172.83

圖1 ?P811對(duì)部分玉米自交系ISSR的擴(kuò)增圖譜

2.2 聚類(lèi)分析

將構(gòu)建好的ISSR數(shù)據(jù)輸入DPS 6.50中，應(yīng)用類(lèi)平均法（UPGMA）獲得聚類(lèi)圖（圖3）。在遺傳相似系數(shù)為0.55處，40份玉米自交系可以分為5個(gè)類(lèi)群。第Ⅰ類(lèi)包括C190、C192、C200、C191、C193、C194、H391、C203、C205、昌72、9903共11個(gè)株系;第Ⅱ類(lèi)包括C195、C204、鄭58、478、C206、C209、C213、C214、C216、C217、M2、先玉508M、先玉128M、C196、C198、Mo17、H51、先父、K12共19個(gè)株系;第Ⅲ類(lèi)包括C212、C222、C223、C224、C219、C221、C220共7個(gè)株系;第Ⅳ類(lèi)包括C199一個(gè)株系;第Ⅵ類(lèi)包括C202、冀海57 2個(gè)株系。

圖2 P864對(duì)部分玉米自交系ISSR的擴(kuò)增圖譜

圖3 玉米自交系的ISSR親緣關(guān)系聚類(lèi)圖譜

3 討論

分子生物學(xué)的發(fā)展使得種質(zhì)資源之間的遺傳性以及親緣關(guān)系得到了明確。特別是ISSR標(biāo)記技術(shù)，憑借其較好的穩(wěn)定性、試驗(yàn)的可重復(fù)性以及操作簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)[2-4]，廣泛應(yīng)用于基因定位、品種鑒定、遺傳作圖、系統(tǒng)發(fā)育[5]、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)等研究中，特別是應(yīng)用于遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究中[6-7]。

從該試驗(yàn)看，ISSR分子標(biāo)記是一種較為理想的標(biāo)記方法，在一定程度上可以確定各個(gè)種質(zhì)材料之間的遺傳關(guān)系。但由于目前的種質(zhì)材料繁多，特別是經(jīng)過(guò)多年的種植和應(yīng)用，難免會(huì)有基因漂移、突變等因素，所以筆者只能確定該試驗(yàn)材料之間的親緣關(guān)系。該試驗(yàn)卻與公認(rèn)的類(lèi)群分類(lèi)有出入。如鄭58屬于瑞種質(zhì)，Mo17屬于蘭卡斯特種質(zhì)，卻被分在了同一個(gè)類(lèi)群。這也與王寒玉等得出的試驗(yàn)結(jié)論相同[8-9]。另外，讀取條帶時(shí)為人工讀帶，可能會(huì)存在不同的人讀取的條帶會(huì)有所差異，以及聚類(lèi)分析軟件的不相同，這也是試驗(yàn)結(jié)果可能不一致的原因。所以劃分的種群是相對(duì)的。

4 結(jié)論

該研究表明，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)玉米進(jìn)行遺傳多樣性分析是可行的。但此方面研究還應(yīng)與實(shí)際育種工作相結(jié)合，使得育種工作者可以充分了解材料的育種變異信息，有針對(duì)性地選擇親本，有效提高育種效率[10]，培育優(yōu)質(zhì)的新品種，才能更好地為育種工作提供理論依據(jù)。

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