張延華　馬國(guó)紅　宋理平　冒樹(shù)泉　吳君

摘 要：通過(guò)測(cè)定鱸魚(yú)（Lateolabrax japonicas）、鮻魚(yú)（Liza haematocheila）、草魚(yú)（Ctencpharyngodon idellus）和鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）的背部肌肉基本成分及羥脯氨酸的含量，對(duì)其膠原蛋白含量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：4種魚(yú)肉中粗蛋白含量分別為18.23%、19.82%、16.18%、17.07%；膠原蛋白的特征性氨基酸羥脯氨酸含量分別為0.0574%、0.0646%、0.0781%、0.0743%，膠原蛋白含量分別為0.6371%、0.7159%、0.8669%、0.8247%。結(jié)果表明：僅從蛋白質(zhì)含量來(lái)看，魚(yú)肉是一種很好的蛋白質(zhì)來(lái)源，并且海水魚(yú)優(yōu)于淡水魚(yú)。但魚(yú)肉中膠原蛋白含量很低，表明魚(yú)肉不適合作為膠原蛋白的提取原料。

關(guān)鍵詞：魚(yú)肉；營(yíng)養(yǎng)成分；羥脯氨酸；膠原蛋白；比色法

中圖分類號(hào)：S985.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 論文編號(hào)：2013-0882

0 引言

膠原蛋白又稱膠原，是動(dòng)物體內(nèi)結(jié)締組織的重要組成成分，約占其體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量的1/4[1]。膠原蛋白含有豐富的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸。羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）是膠原蛋白的特征性氨基酸，通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的含量，然后乘以相應(yīng)的系數(shù)就可以得到膠原蛋白的含量。羥脯氨酸的測(cè)定包括比色法、氨基酸分析儀法和HPLC法、電泳法等，以比色法最為常用[2]。

提取膠原蛋白的傳統(tǒng)原料主要是陸生哺乳動(dòng)物，如豬、牛的皮和骨。由于近年來(lái)哺乳動(dòng)物疫病的爆發(fā)和人畜共患病的增加，世界各國(guó)都在積極尋找新的膠原蛋白來(lái)源，同時(shí)漁業(yè)養(yǎng)殖的大規(guī)模發(fā)展使水產(chǎn)膠原蛋白替代哺乳動(dòng)物成為可能。不少學(xué)者對(duì)魚(yú)類組織中的羥脯氨酸進(jìn)行測(cè)定，為尋找新的膠原蛋白原料提供理論依據(jù)。張俊杰[3]曾用比色法測(cè)定魚(yú)鱗中羥脯氨酸；胡建平[4]對(duì)魚(yú)骨中的羥脯氨酸進(jìn)行過(guò)測(cè)定，魚(yú)皮中的羥脯氨酸含量也有過(guò)報(bào)道，但魚(yú)肉中羥脯氨酸的含量卻鮮有報(bào)道。本研究分別選取2種海水魚(yú)鱸魚(yú)、鮻魚(yú)，2種淡水魚(yú)草魚(yú)、鯉魚(yú)作為研究對(duì)象，擬對(duì)其魚(yú)肉中的羥脯氨酸含量用比色法進(jìn)行測(cè)定，以期為充分開(kāi)發(fā)魚(yú)體組織中的膠原蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鱸魚(yú)、鮻魚(yú)、草魚(yú)、鯉魚(yú)均購(gòu)自濟(jì)南市某水產(chǎn)品市場(chǎng)，魚(yú)體健康無(wú)病，體重1 kg左右。冰塊保存運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，每尾魚(yú)分別取背部的肌肉（由于受生長(zhǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)條件、魚(yú)體大小等因素的影響，魚(yú)體不同部位肌肉所測(cè)得的結(jié)果會(huì)有差異。就同種魚(yú)類來(lái)說(shuō)，魚(yú)體背部肌肉的營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)比較穩(wěn)定。為了便于取樣和比較，本研究中的采樣統(tǒng)一取背部肌肉即自魚(yú)體兩側(cè)鰓蓋骨后至尾鰭前取體背部肌肉作為樣品進(jìn)行測(cè)定），用刀將肉在冷凍時(shí)（0℃以下）切成小塊（約0.5 cm3，邊長(zhǎng)約為 8 mm），置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，一部分用于常?guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定，一部分用于羥脯氨酸的測(cè)定。

1.2 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

水分含量測(cè)定采用105℃烘干失水法[5]，粗蛋白測(cè)定采用微量凱式定氮儀法[6]，粗脂肪測(cè)定采用索氏抽提法[7]，灰分測(cè)定采用550℃干法灰化法[8]。

1.3 羥脯氨酸含量的測(cè)定[9]

1.3.1 基本原理 用硫酸于105℃水解試樣，過(guò)濾、稀釋水解產(chǎn)物。羥脯氨酸經(jīng)氯胺T氧化后，與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色化合物，在波長(zhǎng)558 nm處進(jìn)行比色測(cè)定。

1.3.2 試劑配制

①硫酸溶液[c（H2SO4）≈3 mol/L]：量取750 mL水于2 L的容量瓶中，在攪拌下緩慢加入320 mL濃硫酸。冷卻至室溫后用水定容。

②緩沖溶液（pH=6.8）：26.0 g一水檸檬酸（C6H8O7·H2O），14.0 g氫氧化鈉，78.0 g無(wú)水乙酸鈉[Na（CH3CO2）]，用500 mL水溶解上述試劑并轉(zhuǎn)入1 L的容量瓶中，加入250 mL正丙醇，用水定容。該溶液于4℃暗處可穩(wěn)定保存幾周。

③氯胺T溶液：稱取1.41 g氯胺T，用100 mL緩沖溶液溶解。臨用前配制。

④顯色劑：稱取10.0 g對(duì)二甲氨基苯甲醛，用 35 mL高氯酸溶液[60%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）]溶解，緩慢加入 65 mL異丙醇。臨用前配制。

⑤羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取50.0 mg羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用水溶解，加一滴3 mol/L硫酸溶液，用水定容至刻度。該溶液在4℃下能穩(wěn)定存放1個(gè)月。

⑥羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取5.00 mL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于250 mL容量瓶中，用水定容。分別吸取該溶液10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，所得標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度依次為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ?g/mL。臨用前配制。

1.3.3 儀器和設(shè)備 電熱干燥箱、電熱恒溫水浴鍋、721-分光光度計(jì)（可用波長(zhǎng)558 nm±2 nm）、電子天平、容量瓶、表面皿、比色皿、平底燒瓶、圓形濾紙、不透明塑料薄膜、pH計(jì)等。

1.3.4 測(cè)定步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別移取4.00 mL羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液于比色管中，加入2.00 mL氯胺試劑，混合后于室溫下放置（20±1） min。加入2.00 mL顯色劑于比色管中，充分混合，用塑料薄膜將比色管封口，迅速放入60℃水浴中，加熱20 min。取出比色管，用流動(dòng)水冷卻比色管至少3 min ，在室溫下放置 30 min。用水作參比，于（558±2） nm處用分光光度計(jì)測(cè)定吸收值。

以扣除了空白的標(biāo)準(zhǔn)工作液的吸光度為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）羥脯氨酸含量的測(cè)定。①試樣制備。將切好的試樣裝入耐熱塑料袋中，70℃以上保溫30 min后，冷卻。用絞肉機(jī)將試樣均質(zhì)。將試樣裝入密封的容器中，防止變質(zhì)和成分變化。試樣應(yīng)在均質(zhì)后24 h內(nèi)盡快分析。在待測(cè)試樣保存、制備、稱重過(guò)程中，試樣需混合均勻，特別是脂肪和液體要保持均勻。②水解。稱取4 g試樣（精確至0.001 g）于燒瓶中，避免試樣粘在燒瓶壁上。量?。?0±1） mL硫酸溶液，加入燒瓶中，用表面皿蓋住，于105℃干燥箱內(nèi)恒溫16 h。用圓形濾紙趁熱將水解產(chǎn)物過(guò)濾至250 mL容量瓶中。用10 mL硫酸溶液分3次洗滌燒瓶和濾紙，合并至上述容量瓶中。用水定容，搖勻。③測(cè)定。用移液管移取一定體積（V）的水解產(chǎn)物至250 mL容量瓶中，定容后羥脯氨酸的濃度在0.5～2 ?g/mL之間。移取4.00 mL上述溶液于比色管中，加入2.00 mL氯胺 試劑，混合后于室溫下放置（20±1） min。加入2.00 mL顯色劑于比色管中，充分混合，用塑料薄膜將比色管封口，迅速放入60℃水浴中，加熱20 min。取出比色管，用流動(dòng)水冷卻比色管至少3 min ，在室溫下放置30 min。用水作參比，于（558±2） nm處用分光光度計(jì)測(cè)定吸收值。

扣除空白溶液的吸收，從所得標(biāo)準(zhǔn)曲線查得水解產(chǎn)物中羥脯氨酸的含量。

試樣中羥脯氨酸的含量按式（1）計(jì)算。

X=6.25c/（m×V）…（1）

式中：X：試樣中羥脯氨酸的含量，%；c：由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中羥脯氨酸的濃度，單位為微克每毫升（?g/mL）；m：試樣質(zhì)量，單位為克（g）；V：從250 mL容量瓶中吸取濾液的體積，單位為毫升（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的4種魚(yú)肉基本營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。可以看出，幾種魚(yú)肉中都含有大量的水分，其中鱸魚(yú)、草魚(yú)都在78%以上，4種魚(yú)肉中干物質(zhì)分別占21.6%、23.95%、21.23%、25.68%，在這些干物質(zhì)中大部分為蛋白質(zhì)，分別占干物質(zhì)總量的84.41%、82.75%、76.22%、66.48%，海水魚(yú)>淡水魚(yú)。因此，僅從蛋白質(zhì)含量來(lái)說(shuō)，魚(yú)肉是一種很好的蛋白質(zhì)來(lái)源，并且海水魚(yú)優(yōu)于淡水魚(yú)。四種魚(yú)肉中鯉魚(yú)的脂肪含量最高，鱸魚(yú)、鮻魚(yú)相差不大，灰分含量鱸魚(yú)>鮻魚(yú)>草魚(yú)>鯉魚(yú)。

2.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照“1.3.4”中（1）的方法，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度和吸光度如表2所示。

以羥脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程為：y=0.1692x+0.0018，相關(guān)系數(shù)R2=0.9856，因此，吸光度和羥脯氨酸濃度之間有很好的相關(guān)性，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

2.3 肉樣羥脯氨酸及膠原蛋白含量

將四種魚(yú)的肌肉樣品（每種魚(yú)肉樣設(shè)3個(gè)平行），測(cè)定吸光度并計(jì)算Hyp濃度，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，4種魚(yú)肉中羥脯氨酸含量分別為0.0574%、0.0646%、0.0781%、0.0743%，膠原蛋白含量分別為0.6371%、0.7159%、0.8669%、0.8247%。其中，草魚(yú)、鯉魚(yú)之間無(wú)顯著性差異，鱸魚(yú)、鮻魚(yú)之間有顯著性差異，海水魚(yú)膠原蛋白含量低于淡水魚(yú)。

3 討論

本研究對(duì)2種海水魚(yú)鱸魚(yú)、鮻魚(yú)，2種淡水魚(yú)草魚(yú)、鯉魚(yú)的基本成分及膠原蛋白含量進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：4種魚(yú)肉中干物質(zhì)分別占21.6%、23.95%、21.23%、25.68%，在這些干物質(zhì)中大部分為蛋白質(zhì)，分別占干物質(zhì)總量的84.41%、82.75%、76.22%、66.48%。蛋白質(zhì)是評(píng)價(jià)魚(yú)肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，因此，僅從蛋白質(zhì)含量來(lái)看，魚(yú)肉是一種很好的蛋白質(zhì)來(lái)源，并且海水魚(yú)優(yōu)于淡水魚(yú)。

通過(guò)本試驗(yàn)測(cè)定得知，鱸魚(yú)、鮻魚(yú)、草魚(yú)、鯉魚(yú)肌肉中羥脯氨酸含量分別為0.0574%、0.0646%、0.0781%、0.0743%。由于羥脯氨酸含量穩(wěn)定，在其他蛋白中很少見(jiàn)，為膠原蛋白所特有，所以可以通過(guò)測(cè)定它來(lái)推算膠原蛋白的含量，據(jù)文獻(xiàn)，一般水產(chǎn)動(dòng)物多采用11.1的換算系數(shù)[10]，據(jù)此推算，鱸魚(yú)、鮻魚(yú)、草魚(yú)、鯉魚(yú)的魚(yú)肉膠原蛋白含量分別為0.6371%、0.7159%、0.8669%和0.8247%，分別占魚(yú)肉總蛋白含量的3.49%、3.61%、5.36%、4.83%。說(shuō)明在魚(yú)肉中膠原蛋白含量很低，并且海水魚(yú)低于淡水魚(yú)。

根據(jù)文獻(xiàn)，魚(yú)皮中的羥脯氨酸含量鱈魚(yú)皮（1.34%）[11]、軍曹魚(yú)皮[12]（1.81%）、羅非魚(yú)皮[12]（1.86%）、金槍魚(yú)皮[12]（2.04%）；魚(yú)鱗中的羥脯氨酸含量美國(guó)紅魚(yú)[13] （1.49%），大黃魚(yú)[13]（1.16%），鯉魚(yú)[14]（1.37%）均遠(yuǎn)高于本試驗(yàn)中魚(yú)肉的羥脯氨酸，魚(yú)皮、魚(yú)鱗中的膠原蛋白均可占其粗蛋白含量的70%左右，可見(jiàn)魚(yú)皮、魚(yú)鱗中的蛋白質(zhì)主要是膠原蛋白，可以作為提取膠原蛋白的原料。

本試驗(yàn)4種魚(yú)肉中的羥脯氨酸含量遠(yuǎn)低于魚(yú)皮、魚(yú)鱗，表明魚(yú)體組織中魚(yú)肉的膠原蛋白含量很低，不適合作為膠原蛋白提取的原料。

另外，不少研究證明，肌肉的柔嫩與老化主要決定于肌內(nèi)結(jié)締組織中膠原蛋白的含量并且肌肉結(jié)締組織含量越少、肉越細(xì)嫩，含量越多則肉越粗老。即肌肉中羥脯氨酸含量與肌肉嫩度之間存在明顯的負(fù)相關(guān)。在豬肉[15]、雞肉[16]中此結(jié)論已經(jīng)得到證實(shí)，在本試驗(yàn)中，四種魚(yú)肉的羥脯氨酸含量中鱸魚(yú)<鮻魚(yú)<鯉魚(yú)<草魚(yú)，按照該結(jié)論，鱸魚(yú)肉最細(xì)嫩，草魚(yú)肉最粗老，似乎與人們對(duì)不同魚(yú)肉的喜好相符合。但魚(yú)肉中的羥脯氨酸含量是否是評(píng)價(jià)魚(yú)肉品質(zhì)的指標(biāo)尚需進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)4種魚(yú)肉的基本成分及羥脯氨酸含量的測(cè)定，分析了魚(yú)肉中膠原蛋白的含量，結(jié)果表明僅從蛋白質(zhì)含量來(lái)看，魚(yú)肉是一種很好的蛋白質(zhì)來(lái)源，并且海水魚(yú)優(yōu)于淡水魚(yú)。但魚(yú)肉中膠原蛋白含量很低，表明魚(yú)肉不適合作為膠原蛋白的提取原料。而魚(yú)肉中的羥脯氨酸含量是否可作為評(píng)價(jià)魚(yú)肉品質(zhì)的指標(biāo)尚需進(jìn)一步的研究探討。

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