牛田等

摘 要：利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)42份春蘭品種及1份多花蘭、1份春劍及3份雜交蘭進(jìn)行遺傳多樣性分析。篩選出的15對(duì)引物組合共擴(kuò)增出185個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)184個(gè)，平均每對(duì)引物組合產(chǎn)生12.27個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。引物組合Me8-Em16的Neis基因多樣性數(shù)H（0.3993）、Shannon信息指數(shù)I值（0.5794）和有效等位基因數(shù)Ne（1.7280）都是最高值。47份材料的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.63～0.80，UPGMA聚類分析表明，在遺傳相似系數(shù)為0.662處，將47份材料劃分成5個(gè)類群。本研究較好地揭示了47份材料親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，為春蘭各品種間的分類和雜交親本的選擇提供重要理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：春蘭；SRAP；遺傳多樣性；聚類分析；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)：S311 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 論文編號(hào)：2013-1027

Genetic Diversity Analysis of Cymbidium goeringii 's Germplasm Resources Based on SRAP Markers

Niu Tian1， Zhang Lin2， Wang Houxin2， Li Chengxiu2， Nie Shuo1， Zhu Cuicui1， Wang Changxian2

（1College of Forestry， Shandong Agriculture University， Taian 271018， Shandong， China；

2Taishan Forestry Academe， Taian 271000， Shandong， China）

Abstract： SRAP was used to analyse the genetic diversity analysis of 42 Cymbidium goeringii cultivars and 1 specie of Cymbidium floribundum， 1 specie of Cymbidum longibracteatum and 3 species of hybrid Cymbidium. 15 polymorphic primer combinations were screened and a total of 185 DNA loci were amplified，184 of which were polymorphic. The average number of polymorphic DNA loci amplified by each primer was 12.27. Primer combination Me8-Em16s Neis genetic diversity index （0.3993）， Shannon's information index （0.5794） and Effective number of alleles （1.7280） were the highest. The genetic similarity among 47 germplasm ranged from 0.63-0.80. The UPGMA clustering showed that all the tested cultivars and species were classified into five cluster groups with the similarity coeficient of 0.662. The study were well revealed the 47 materials genetic relatives. The findings of this study would provide an important theoretical basis for Cymbidium goeringii classification and parental selection in cross breeding.

Key words： Cymbidium goeringii； SRAP； Genetic Diversity； Cluster Analysis； Genetic Relationship

0 引言

春蘭（Cymbidium goeringii）屬于蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium），別名朵朵香、草蘭、草素、山花等，地生蘭原種，室內(nèi)觀賞盆栽花卉。在中國(guó)江浙地區(qū)分布較廣，福建、廣東、四川、云南、安徽、江西、臺(tái)灣等地亦有出產(chǎn)，有肉質(zhì)根及球狀的擬球莖，葉叢生而剛韌，狹長(zhǎng)而尖，邊緣粗糙；假鱗莖稍呈球形，葉4～6枚集生，狹帶形，邊緣有細(xì)鋸齒；花單生，少數(shù)2朵，花葶直立，花期2—3月。蘭花是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，距今已有2500多年的栽培歷史。其味清幽，花色淡雅，具有較高的觀賞價(jià)值。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用到春蘭的鑒定中。目前應(yīng)用于春蘭分子標(biāo)記的主要為RAPD、AFLP、ISSR等。季祥彪等[1]采用RAPD標(biāo)記對(duì)貴州野生春蘭遺傳多樣性進(jìn)行分析；陳慧云等[2]利用AFLP分子標(biāo)記對(duì)部分春蘭名品進(jìn)行了DNA指紋圖譜分析；春蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化也已見(jiàn)報(bào)道[3]。但SRAP（sequence-related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）是由Li等[4]開(kāi)發(fā)的一種新型的PCR分子標(biāo)記技術(shù)，它針對(duì)基因外顯子里GC含量豐富而啟動(dòng)子和內(nèi)含子里AT含量豐富的特點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，因不同個(gè)體的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性，具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、共顯性高、重復(fù)性高、易于分離條帶及測(cè)序的特點(diǎn)[5]，在基因組中分布均勻，但是同樣易受到反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序變化的影響。目前SRAP主要應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)、種緣進(jìn)化關(guān)系、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、重要性狀標(biāo)記以及比較基因組學(xué)等方面。目前關(guān)于利用SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析的文章未見(jiàn)報(bào)道，本研究利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)42份春蘭品種及1份多花蘭、1份春劍及3份雜交蘭進(jìn)行遺傳多樣性分析，擬為春蘭各品種間的分類和雜交親本的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為山東省泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)中心提供的42個(gè)春蘭不同品種及作為對(duì)照材料的1份多花蘭、1份春劍及3種雜交蘭，其品種名及編號(hào)詳見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取 取幼嫩葉片用硅膠干燥，采用改良的CTAB法[6]提取基因組DNA，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。所有DNA樣品稀釋至50 ng/μL，于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SRAP-PCR擴(kuò)增 采用篩選優(yōu)化后的SRAP-PCR體系（25 μL），包括超純水14.5 μL，buffer緩沖液2.5 μL，Mg2+濃度2.5 mmol/L，引物濃度為1.2 μmol/L，dNTP濃度2 mmol/L，Taq聚合酶0.5 U，DNA模板為90 ng。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，反應(yīng)前5個(gè)循環(huán)為94℃變性1 min、35℃復(fù)性1 min、72℃延伸1 min；后30個(gè)循環(huán)退火溫度50℃，72℃延伸50 s；循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳緩沖液為1×TAE，電壓120 V。凝膠經(jīng)溴化乙錠（EB）染色后置于凝膠成像系統(tǒng)上采集圖像。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 擴(kuò)增條帶中只統(tǒng)計(jì)清晰、易于辨認(rèn)的條帶，結(jié)果采用二元性狀編碼，即有帶表示為1，無(wú)帶表示為0[7-9]。采用POPGENE1.32軟件計(jì)算每對(duì)SRAP引物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率，Nei遺傳多樣性指數(shù)H和Shannon信息指數(shù)I，并利用NTSYS 2.10e軟件根據(jù)Nei遺傳相似系數(shù)采用UPGMA（未加權(quán)平均法）進(jìn)行聚類[10-12]，并繪出聚類分析樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

本試驗(yàn)所用的正反向引物序列見(jiàn)表2，從170對(duì)引物組合中篩選出條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物15對(duì)。對(duì)47份蘭花種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1、圖2），擴(kuò)增結(jié)果表明，篩選出的不同引物組合擴(kuò)增出的DNA片段長(zhǎng)度在250～5000 bp。15對(duì)引物組合在47份材料中共檢測(cè)到185個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)184個(gè)，多態(tài)性比率達(dá)99.46%，平均每對(duì)引物組合產(chǎn)生12.27個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。其中引物組合Me6-Em4多態(tài)性比率最低為90%；Me8-Em16的Neis基因多樣性數(shù)（0.3993）、Shannon信息指數(shù)（0.5794）和有效等位基因數(shù)（1.7280）都是最高值。

2.2 聚類分析

根據(jù)篩選出的15對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增結(jié)果，采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析（圖3），得出春蘭種質(zhì)資源的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖，結(jié)果顯示47份蘭花種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)為0.63～0.80。其中3組品種組合的遺傳相似系數(shù)（0.80）最大，分別是同樣來(lái)自于浙江紹興的奇花類牡丹瓣的‘天彭牡丹和‘錦繡中華，‘金汪字和‘新梅以及同樣來(lái)自于四川成都的梅瓣類的‘綠梅和‘黃梅。在遺傳相似系數(shù)為0.662處，將47份材料劃分成5個(gè)類群，第Ⅰ類群又在遺傳相似系數(shù)為0.67處，劃分為兩大亞類群；第Ⅱ類群都屬于“春蘭老八種”，分別是瓣型為水仙瓣的3號(hào)‘汪字和瓣型為梅瓣的7號(hào)‘萬(wàn)字；第III類群為瓣型為荷瓣的5號(hào)‘環(huán)球荷鼎；第IV類群為瓣型為多瓣的18號(hào)‘四喜蝶；第Ⅴ類群又在遺傳相似系數(shù)為0.691處，劃分為2個(gè)亞類群，其中45號(hào)春劍品種‘隆昌素和47號(hào)蕙蘭品種為一類；40號(hào)多花蘭品種和46號(hào)多花蘭與蕙蘭雜交品種為一類，二者表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，主要是46號(hào)雜交品種的父母本有一個(gè)是多花蘭品種，這與聚類分析結(jié)果基本一致。

聚類分析結(jié)果表明，來(lái)自于相同地區(qū)的春蘭品種的親緣關(guān)系較近，如在第Ⅰ類群劃分的第2亞類群中，來(lái)自于四川成都的38號(hào)‘綠梅、41號(hào)‘大富貴、42號(hào)‘宋梅、43號(hào)‘黃梅和44號(hào)‘集圓歸為一類，同時(shí)與來(lái)自于浙江紹興的47號(hào)‘新梅正好分開(kāi)，47號(hào)單獨(dú)為一類；但也存在著來(lái)源于不同地區(qū)的品種親緣關(guān)系較近的現(xiàn)象，同樣在在第Ⅰ類群劃分的第2亞類群中，來(lái)自于四川成都的36號(hào)‘簪梅與來(lái)自于浙江紹興的27號(hào)‘紅宋梅親緣關(guān)系較近，劃分為一類，說(shuō)明不同地區(qū)的春蘭品種之間的遺傳距離差距雖然比較遠(yuǎn)，但由于各地之間蘭花市場(chǎng)的交易頻繁以及經(jīng)過(guò)人工馴化，來(lái)源于不同地區(qū)的優(yōu)良品種間的雜交現(xiàn)象還是存在的。

3 結(jié)論

本研究利用篩選出的15對(duì)特異性引物組合擴(kuò)增出185個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)184個(gè)，多態(tài)性比率達(dá)99.46%，而朱根發(fā)等[13]對(duì)大花蕙蘭種質(zhì)進(jìn)行AFLP分析時(shí)，64對(duì)引物中篩選出多態(tài)性引物9對(duì)，多態(tài)性引物比率僅為14.1%。李冬梅等[14]利用RAPD標(biāo)記分析了大花蕙蘭種質(zhì)資源親緣關(guān)系，100個(gè)引物中篩選出20個(gè)引物，引物多態(tài)性百分率也僅有20%。陳惠云等[2]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)18種名貴春蘭品種進(jìn)行了DNA指紋圖譜分析，篩選出16對(duì)引物，共擴(kuò)增出345條帶，其中有多態(tài)性帶169條，多態(tài)性百分率為48.99%。李鈞敏等[15]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)30個(gè)西蘭花栽培新品種進(jìn)行分析，結(jié)果顯示22個(gè)特異引物共擴(kuò)增出229條譜帶，其中多態(tài)性條帶有109條，多態(tài)性帶比例僅為47.60%。由此可知，SRAP多態(tài)性較好，效率也很高，可以提供更豐富的遺傳信息，獲得更可靠的結(jié)果。同時(shí)本研究所得的結(jié)果表明SRAP在春蘭種質(zhì)遺傳多樣性研究中具有高效性，同時(shí)47份材料具有較豐富的遺傳多樣性。

利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同植物擴(kuò)增結(jié)果也是有所不同的，而且效率也是不相同的。歐陽(yáng)冬梅等[16]利用SRAP標(biāo)記對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外蓮屬40份材料進(jìn)行分析。11對(duì)特異性引物共擴(kuò)增了184條條帶，多態(tài)性條帶127條，多態(tài)性帶比例為69.0%。文雁成等[17]采用SRAP標(biāo)記對(duì)建國(guó)以來(lái)不同時(shí)期選育的130個(gè)品種進(jìn)行分析，25個(gè)SRAP引物組合共擴(kuò)增到509個(gè)譜帶，其中123個(gè)多態(tài)性條帶，多態(tài)性帶百分率為24%。趙秀娟等[18]從144對(duì)SRAP引物中篩選出61對(duì)多態(tài)性強(qiáng)、重復(fù)性好的SRAP引物，對(duì)43份苦瓜種質(zhì)DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，共得到2078條譜帶，其中多態(tài)性譜帶863條，多態(tài)性帶比例為42.11%。以上差異可能與不同植物所具有的基因組不同及所篩選的引物組合不同有關(guān)。SRAP在春蘭遺傳多樣性上表現(xiàn)出高效性，將為春蘭親緣關(guān)系鑒定方面提供重要技術(shù)支撐。

4 討論

從聚類分析樹(shù)狀圖可以看出，47份蘭花種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)為0.63～0.80，各品種間表現(xiàn)出較高的親緣關(guān)系；春蘭品種與作為對(duì)照的非春蘭品種蕙蘭、多花蘭和春劍等遺傳相似系數(shù)（0.63）最小，表現(xiàn)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這與嚴(yán)華[19]對(duì)不同種國(guó)蘭親緣關(guān)系的ISSR分析結(jié)果基本一致。47份材料在表型性狀中也表現(xiàn)出較高的多樣性，從葉色、葉形、葉姿、花色、瓣型等都表現(xiàn)出很大差異，而其中遺傳相似系數(shù)最大（0.80）的2個(gè)品種‘天彭牡丹和‘錦繡中華在形態(tài)學(xué)上也表現(xiàn)出一致性：葉片較長(zhǎng)，葉夾角較大，葉姿較直立，葉片為淺綠色，瓣型為奇花類牡丹瓣。但瓣型為水仙瓣的3號(hào)‘汪字和梅瓣的7號(hào)‘萬(wàn)字同屬于第Ⅱ類群，這與蘭花傳統(tǒng)瓣型分類存在差異，二者的分類仍有待于進(jìn)一步研究。

在形態(tài)學(xué)分類上，春蘭品種主要依據(jù)株型、花瓣、花色、葉型、葉藝等形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)分，有一定的局限性。有關(guān)研究報(bào)道，在蘭科植物中，如果其他基因插入到控制花顏色的基因中，會(huì)導(dǎo)致花顏色的改變[20]。因此，針對(duì)內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域AT含量豐富而與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而進(jìn)行特異擴(kuò)增的SRAP分子標(biāo)記技術(shù)能夠比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類更為有效地鑒定出春蘭各品種間的親緣關(guān)系。

由于整個(gè)蘭花市場(chǎng)需求量的不斷加大，蘭花交易額也隨之遞增。目前市場(chǎng)上春蘭等國(guó)蘭的價(jià)格飆升，導(dǎo)致農(nóng)民上山大量采挖蘭花野生資源，許多春蘭的名品破壞嚴(yán)重，野生資源變得越來(lái)越稀缺，因此春蘭種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與保護(hù)顯得尤為重要。本研究結(jié)果表明不同來(lái)源地的絕大部分春蘭品種之間的親緣關(guān)系距離較遠(yuǎn)，因此，地方對(duì)春蘭品種種質(zhì)資源的保護(hù)對(duì)保持當(dāng)?shù)卮禾m品種豐富的遺傳多樣性具有重要作用。本研究較好地揭示了春蘭各品種之間的親緣關(guān)系，但由于技術(shù)有一定的局限性，在隨后的工作中將結(jié)合其他手段和技術(shù)對(duì)其做進(jìn)一步的探索，為春蘭種質(zhì)資源的利用與保護(hù)奠定更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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