蔣向輝　劉良科　佘朝文

摘要：在對葛屬11份種質(zhì)核rDNA ITS序列克隆測序的基礎(chǔ)上，用MEGA 6.0軟件對11份種質(zhì)及其近緣種進行聚類分析。結(jié)果表明，葛屬11份種質(zhì)的ITS序列在長度和G+C含量上相差較大，長度變化在669～765 bp之間，最大相差96 bp，G+C含量在52.98%～59.89%，最大相差6.91%；藤縣粉葛（Tengxian Pueraria thomsonii）、常德粉葛（Changde Pueraria thomsonii）、武隆苦葛（Wulong Pueraria peduncularis）這3個種的ITS序列特點相近，G+C含量都在53.74%左右，長度小于700 bp，在發(fā)育樹上聚為1類，種質(zhì)親緣關(guān)系很近；合川粉葛（Hechuan Pueraria thomsonii）和蒙自粉葛（Mengzi Pueraria thomsonii） ITS序列相似性較高，G+C含量與序列長度都相差不大，在發(fā)育樹上聚為1類；通道山葛（Tongdao Pueraria montana）聚為1類，與其他物種存在較遠的距離；德興宋氏超級粉葛（Dexing Soong Super Pueraria thomsonii）與常寧野葛（Changning Pueraria lobata）ITS序列和G+C含量一樣，在發(fā)育樹上聚為1類，但與會同山葛（Huitong Shange）、大衛(wèi)粉葛（Dawei Pueraria thomsonii）處于不同的分支上，親緣關(guān)系相對較遠。

關(guān)鍵詞：葛屬；ITS序列；親緣關(guān)系；聚類分析

中圖分類號： S567.902.4 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0046-04

葛（Pueraria lobata）別稱葛藤、葛麻葉，系豆科碟形花亞科（Phaseolease）葛屬植物，最先產(chǎn)于中國和日本的琉球地區(qū)[1]，中國最早關(guān)于葛的記載是在《詩經(jīng)》和《神農(nóng)本草經(jīng)》上。世界上葛有20個種，我國有12個種，其中常被作為藥用的有8個種，我國除新疆維吾爾自治區(qū)、西藏壯族自治區(qū)和青?；刈遄灾螀^(qū)3個省份外，其他省份都有葛分布的相關(guān)報道，產(chǎn)量高和資源比較豐富的種類有野葛與粉葛[2]。葛莖是我國南方一些省（區(qū)）的一種常食蔬菜，葛根含異黃酮成分葛根素、葛根素木糖苷、大豆黃酮、大豆黃酮苷及β-谷甾醇、花生酸，又含多量淀粉，有解表退熱、生津止渴、止瀉的功能，能改善高血壓、糖尿病病人的項強、頭暈、頭痛等癥狀[3]。葛根毒性低、藥源廣、價格低，因此，加強對葛根的新藥和保健品開發(fā)具有良好的前景。

根據(jù)2010版《藥典》規(guī)定，野葛和粉葛都可以作為葛的正品使用，但它們是同科不同屬的2種植物，有效成分含量差異較大，在開發(fā)利用中對其來源的均一性難以保證，因此，采用合適的標(biāo)記對葛種質(zhì)資源進行親緣關(guān)系分析具有重要的意義。葛屬不同種之間形態(tài)差異較小，根據(jù)形態(tài)學(xué)來判定葛屬種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系存在較多的爭議，目前，國內(nèi)在分子水平上鑒定葛屬種質(zhì)之間親緣關(guān)系的研究報道尚少。本研究基于ITS序列對葛屬11份種質(zhì)進行聚類分析，在分子水平上進一步鑒定葛屬11份種質(zhì)的親緣關(guān)系，為葛屬不同來源的種質(zhì)區(qū)分與鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為葛屬不同來源的11種種質(zhì)（表1）。

1.2 試驗方法

采用改良的CTAB法提取葛屬11份種質(zhì)基因組DNA。用于擴增的ITS序列引物參照White等設(shè)計的ITS通用引物[4]，上游引物為ITS5：GGAAGGTAAAAGTCAAGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。擴增程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物回收采用長沙安比奧生物試劑有限公司生產(chǎn)的DNA回收試劑盒，將回收產(chǎn)物與pMD 18-T質(zhì)粒相連，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌（E. coil）DH5α（菌株來自湖南大學(xué)生物學(xué)院）；獲得重組菌斑，采用長沙安比奧生物試劑有限公司生產(chǎn)的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，在雙酶切鑒定后送上海生物工程有限公司進行測序，測得序列經(jīng)比對確認，將序列在GENEBANK上登錄，獲得登錄號。根據(jù)獲得的序列，以NCB網(wǎng)站已有的甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]ITS序列為外類群，利用MEGA 6.0軟件，分別采用MP法、NJ法和UPGMA法3種方法對11份種質(zhì)及其近緣種進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列分析

一般情況下，每個物種DNA中G+C的含量是特定的，能夠反映屬種之間的親緣關(guān)系，DNA中G+C含量越高，其變異也越??；親緣關(guān)系越近，不同物種之間DNA中G+C含量的差別越小[5]。由表2可見，11份種質(zhì)ITS序列G+C含量有很大的差異，G+C含量在52.98%～59.89%之間，最大相差6.91百分點，其中大衛(wèi)粉葛G+C含量相對最高，ITS1序列中G+C含量為54.08%～64.05%，ITS2序列中G+C含量為5169%～64.19%，ITS1序列G+C含量比ITS2序列變化稍大；序列長度波動范圍也較大，大小在669～765 bp，相差 96 bp，其中，通道山葛的ITS序列相對最長；德興宋氏超級粉葛和常寧野葛G+C含量和序列長度相同，G+C含量為5458%，序列長度為731 bp；常德粉葛和蒙自粉葛G+C含量和序列長度相似。從序列長度來看，ITS1序列的變異范圍在242～331 bp之間，ITS2序列的變異范圍在178～279 bp，5.8S序列相對保守，序列長度在169 bp左右。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

由表3可見，葛屬11份種質(zhì)和外類群植物甘薯的遺傳距離為0.002～0.792，藤縣粉葛與武隆苦葛、德興宋氏超級粉葛與常寧野葛、藤縣山葛與會同山葛的遺傳距離均最小，為0.002，相互間的親緣關(guān)系最為接近；其次是常德粉葛與武隆苦葛，遺傳距離為0.004；遺傳距離最大的是蒙自粉葛與番薯，達到0.792，這兩者的親緣關(guān)系相對最遠。