溫映紅　楊明霞　王俊宇　韓鳳

摘 要：概述了近年來國內(nèi)外關(guān)于生物技術(shù)在草莓遺傳育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展。重點(diǎn)對草莓組織培養(yǎng)技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)、基因工程技術(shù)在草莓遺傳育種中發(fā)揮的作用及應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)，主要包括組織培養(yǎng)應(yīng)用于草莓育苗，利用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建及抗病性輔助選擇，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行草莓基因功能驗(yàn)證及遺傳性狀定向改良等，分析了各種現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用于育種研究的可行性。最后，對各種生物技術(shù)的局限性進(jìn)行了總結(jié)和歸納，探討了現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合的利用途徑及發(fā)展方向，旨在為今后草莓遺傳育種工作提供參考和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：生物技術(shù)；草莓；遺傳育種

中圖分類號：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 論文編號：2014-0209

Application of Biotechnology in Genetics and Breeding of Strawberry

Wen Yinghong， Yang Mingxia， Wang Junyu， Han Feng

（Pomology Institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taigu 030815， Shanxi， China）

Abstract： This review introduced the progress about application of biotechnology in the strawberry genetics and breeding from abroad and home researches in recent years. The role and the status of application about tissue culture technology， molecular markers and genetic engineering technology in the strawberry genetics and breeding were summarized mainly including the application of tissue culture in strawberry breeding， the using of molecular markers about the constructing of genetic maps and molecular marker-assisted selection for disease resistance， the using of genetic engineering technology about functional verification of strawberry genes and the directional genetic improvement of horticultural traits and so on. The feasibility of modern biotechnologies were applied to breeding research was analyzed as well. Finally， the limitations of various biotechnologies were summarized， the utilization way and development direction of modern biotechnology combined with conventional breeding technology was discussed. Overall， this review aimed at offering basic knowledge about genetic breeding work of strawberry.

Key words： Biotechnology； Strawberry； Genetics and Breeding

0 引言

草莓是薔薇科草莓屬的一種多年生宿根草本植物，是溫帶地區(qū)的一種常見水果。其果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值較高，因此深受人們喜愛。草莓在各種漿果中，全球栽培面積和產(chǎn)量均位居前列。近年來，國內(nèi)草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，草莓栽培面積也在不斷擴(kuò)大。良好的發(fā)展前景為草莓遺傳育種工作帶來新的機(jī)遇。

長久以來，草莓育種者已經(jīng)利用常規(guī)育種方法培育了許多優(yōu)良草莓品種。隨著草莓產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，生產(chǎn)上對優(yōu)質(zhì)草莓種苗的需求不斷增加，同時(shí)為適應(yīng)國際市場，不同類型草莓品種的需求也在不斷增長。常規(guī)育種方法往往由于育種周期長以及大量的人力物力消耗等原因而無法滿足日益增長的草莓生產(chǎn)發(fā)展需要。近些年現(xiàn)代生物技術(shù)的興起為目前植物遺傳育種工作帶來了新的前景，同時(shí)已顯示出巨大潛力。生物技術(shù)在草莓遺傳育種上的應(yīng)用發(fā)展與其他主要作物相比進(jìn)展較慢，但隨著先進(jìn)技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，生物技術(shù)對草莓遺傳育種工作起到了顯著的推動作用，同時(shí)也取得了一定的成績。筆者主要概述了目前現(xiàn)代生物技術(shù)在草莓遺傳育種中的應(yīng)用與研究進(jìn)展，探討生物技術(shù)應(yīng)用于植物遺傳育種工作的發(fā)展方向。

1 組織培養(yǎng)與草莓遺傳育種

草莓組織培養(yǎng)研究較早，莖尖、葉片、花藥、原生質(zhì)體等組織器官培養(yǎng)方面的研究均比較全面，因此組織培養(yǎng)將成為草莓品種改良的一種重要措施。盡管草莓組培苗在生產(chǎn)上的應(yīng)用越來越廣泛，但是近年來多項(xiàng)研究表明，組培效應(yīng)會導(dǎo)致草莓組培苗發(fā)生體細(xì)胞無性系變異。Morozova[1]研究表明，草莓的離體培養(yǎng)和再生植株會發(fā)生形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和遺傳物質(zhì)等方面的變異。張馨宇等[2]發(fā)現(xiàn)草莓組培苗繁殖的匍匐莖子苗數(shù)量顯著高于普通苗并且后代在結(jié)果期生長勢較強(qiáng)，產(chǎn)量增加，但抗病性會有所下降，這種變異被認(rèn)為是一種表觀遺傳變異。因此組培誘導(dǎo)的這些變異具有兩重性，一方面將影響生產(chǎn)上用苗的品種一致性以及果實(shí)產(chǎn)量與質(zhì)量，而另一方面也為草莓的種質(zhì)創(chuàng)新及新品種的選育創(chuàng)造了一個(gè)新的途徑。組培誘導(dǎo)效應(yīng)引起植物變異的機(jī)理至今還不是很清晰，加強(qiáng)這方面的理論研究對今后的草莓遺傳育種工作具有重要的創(chuàng)新意義。

1.1 草莓莖尖、葉片、花瓣培養(yǎng)

草莓莖尖培養(yǎng)是進(jìn)行草莓種苗脫毒的主要方法。草莓匍匐莖的莖尖是較為方便且常用的取材部位，莖尖和分生組織培養(yǎng)在遺傳與形態(tài)上較其他部位穩(wěn)定[3]，而且更容易再生，適于大量擴(kuò)繁。近些年很多研究者對草莓莖尖培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇及培養(yǎng)方式等方面進(jìn)行了較為全面的研究[4-5]，這為草莓組培苗應(yīng)用于生產(chǎn)及工廠化育苗提供了一定的理論基礎(chǔ)。草莓葉片、花瓣等器官培養(yǎng)可以通過誘導(dǎo)草莓離體器官再生獲得穩(wěn)定的草莓再生體系，從而獲得大量的植物材料，為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化與新品種選育工作奠定基礎(chǔ)。董莉等[6]以草莓組培苗葉片為試材建立了‘紅顏草莓葉片高效再生體系。顧地周等[7]通過誘導(dǎo)深山草莓花瓣愈傷組織獲得了再生植株，并證明在適當(dāng)激素和濃度配比條件下可誘導(dǎo)產(chǎn)生穩(wěn)定性狀變異植株。

1.2 草莓子房、花藥與小孢子培養(yǎng)

人工誘導(dǎo)草莓單倍體植株可以通過未受精子房離體培養(yǎng)以及花藥或小孢子培養(yǎng)2種方式獲得。單倍體誘導(dǎo)對于植物倍性育種具有重要的意義，可以有效縮短育種年限。王文和等[8]研究證明離體培養(yǎng)草莓未受精子房獲得單倍體植株的關(guān)鍵在于試材的選擇、激素與蔗糖濃度以及溫度的控制。趙永欽等[9]通過對草莓花藥培養(yǎng)中預(yù)處理方式、花序以及激素種類和配比對愈傷組織形成的影響研究，探索了以草莓花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株的最適培養(yǎng)條件。王萌[10]對野生草莓游離小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，研究了草莓游離小孢子培養(yǎng)的影響因素并獲得了小孢子發(fā)育而來的胚狀體，這是對草莓游離小孢子培養(yǎng)體系的首次探索。

1.3 草莓原生質(zhì)體培養(yǎng)

原生質(zhì)體培養(yǎng)在植物遺傳轉(zhuǎn)化、克服遠(yuǎn)緣雜交障礙、分離和純化突變體等方面起到重要作用，這也是草莓育種的一種重要方法。張學(xué)英等[11]對草莓原生質(zhì)體分離過程中的多項(xiàng)影響因素進(jìn)行了深入研究，探討了草莓原生質(zhì)體分離時(shí)最佳的分離材料、酶液組成、酶解方式及時(shí)間等控制條件，為草莓的原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合等方面研究提供了很有價(jià)值的理論基礎(chǔ)。馮穎等[12]將長白山區(qū)東方草莓和安娜草莓的原生質(zhì)體融合并培養(yǎng)獲得了屬間體細(xì)胞融合的新植株，這證明了草莓原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合應(yīng)用于草莓育種的可行性。

2 分子標(biāo)記與草莓遺傳育種

分子標(biāo)記即一種遺傳標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是能直接反映基因組DNA間差異的DNA片段，其可以反映生物個(gè)體以及種群間基因組中的某種差異。分子標(biāo)記主要可以分為以分子雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記、以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記、以DNA芯片和測序?yàn)榛A(chǔ)的分子標(biāo)記3類。DNA分子標(biāo)記與細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記等相比，具有顯著優(yōu)越性，因此DNA分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于多種植物基因組作圖、基因定位、基因克隆等遺傳育種工作。在近些年草莓遺傳育種工作中，分子標(biāo)記技術(shù)在遺傳圖譜構(gòu)建、抗病性輔助選擇育種等方面起到了突出作用。

2.1 基于分子雜交的分子標(biāo)記

RFLP是最早應(yīng)用于遺傳研究的分子標(biāo)記，其以Southern雜交為基礎(chǔ)，但其成本較高，技術(shù)難度較大。在RFLP的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶及PCR引物可將其轉(zhuǎn)化為成本適宜且易于操作的PCR-RFLP標(biāo)記（即CAPS標(biāo)記），這樣更利于分子圖譜構(gòu)建及分子育種研究。Kunihisa等[13]成功開發(fā)出了可以對不同草莓品種進(jìn)行有效區(qū)分的PCR-RFLP標(biāo)記，這對育種者權(quán)利保護(hù)起到重要作用。此外，GISH與FISH技術(shù)也是以分子雜交為基礎(chǔ)的。翁天均[14]首次利用FISH與GISH技術(shù)對原產(chǎn)中國以及其他國家地區(qū)的48份材料進(jìn)行了系統(tǒng)分類、親緣關(guān)系和多倍體形成等方面的分析與研究，這為草莓屬植物系統(tǒng)分類與進(jìn)化以及多倍體來源研究提供了重要參考依據(jù)。馬鴻翔等[15]利用GISH對黃毛草莓×鳳梨草莓雜種F1的五倍體植株進(jìn)行檢測，從而對黃毛草莓與鳳梨草莓的種間雜交真實(shí)性進(jìn)行了證實(shí)。

2.2 基于PCR的分子標(biāo)記

基于PCR的分子標(biāo)記是種類最多的一類，包括RAPD、AFLP、SSR、SCAR等。近年來這一類型的分子標(biāo)記研究最為廣泛。朱海生等[16]利用RAPD分析了不同繼代次數(shù)草莓組培苗遺傳穩(wěn)定性。韓柏明等[17]利用基于AFLP的一種甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（MSAP）分析了草莓組培苗基因組DNA甲基化程度與DNA甲基化模式的變異。因此分子標(biāo)記可在草莓遺傳穩(wěn)定性研究中起到重要作用。王志剛等[18]曾以RAPD和SCAR標(biāo)記為基礎(chǔ)對草莓品種進(jìn)行鑒定。Yoon等[19]利用SSR標(biāo)記分析了不同來源栽培草莓的遺傳多樣性及群體構(gòu)成。Isobe等[20]利用從已公布的草莓基因序列中收集的4474個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建了一套綜合完整的草莓基因連鎖圖譜，這對草莓遺傳信息分析具有重要意義。曹嫻等[21]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分別獲得了與草莓灰霉病抗性基因連鎖的SSR分子標(biāo)記，而李靜等[22]利用SSR建立了草莓抗炭疽病遺傳圖譜。這說明分子標(biāo)記可應(yīng)用于草莓抗病輔助選擇育種實(shí)踐。

2.3 基于DNA芯片和測序的分子標(biāo)記

SNP是在動植物體內(nèi)均廣泛存在的遺傳標(biāo)記。SNP在遺傳變異連鎖作圖、關(guān)聯(lián)分析、群體分析等遺傳育種工作中具有重要意義，但由于其以芯片技術(shù)與測序?yàn)榛A(chǔ)，成本消耗高，因此在多數(shù)植物研究中還未得到普及。目前，部分研究者已將SNP標(biāo)記利用到草莓研究當(dāng)中。Ge等[23]通過比較16種栽培于南京的草莓品種的EST序列，發(fā)現(xiàn)了116個(gè)SNP位點(diǎn)并用這些SNP多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，說明SNP標(biāo)記可作為品種鑒定與遺傳多樣性分析的強(qiáng)大工具。野生二倍體草莓F. vesca基因組的公布[24]以及其他草莓種類的基因組數(shù)據(jù)的不斷更新將有效加快草莓SNP的預(yù)測與確認(rèn)過程，這將對目前栽培草莓的起源與異源多倍體構(gòu)成等方面的研究有極大的促進(jìn)作用[25]。

3 基因工程與草莓遺傳育種

植物基因工程是在分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)等綜合學(xué)科基礎(chǔ)上建立起來的以植物基因結(jié)構(gòu)功能研究、新品種選育與品種改良等為主要目標(biāo)的一種現(xiàn)代生物技術(shù)。盡管轉(zhuǎn)基因技術(shù)在有關(guān)食品安全以及生態(tài)平衡等方面仍存在諸多爭議，但這一技術(shù)在理論研究以及部分物種品種選育與改良上已經(jīng)取得很多成果?；蚬こ碳夹g(shù)在草莓上的應(yīng)用也漸趨廣泛。通過基因工程手段可以驗(yàn)證草莓基因功能，縮短草莓育種周期，進(jìn)行品種遺傳性狀的定向改良，有效提高育種效率。

3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法

植物遺傳轉(zhuǎn)化有多種方法，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法等。在草莓遺傳轉(zhuǎn)化方面應(yīng)用最為廣泛的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法。近年來，國內(nèi)外許多研究者利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行草莓轉(zhuǎn)基因研究，同時(shí)在抗蟲害、抗病毒與真菌、抗逆性、抗除草劑等諸多方向上獲得轉(zhuǎn)基因植株[26]，開辟了新的草莓育種途徑。但是這種方法存在一定的缺陷，主要體現(xiàn)在這種方法受較多因素的影響，其轉(zhuǎn)化效率較低。Husaini[27]就曾對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓微繁殖苗轉(zhuǎn)化過程進(jìn)行深入研究，其認(rèn)為培養(yǎng)時(shí)間和篩選條件等對轉(zhuǎn)化率有較大影響。Pantazis等[28]研究了一種在森林草莓上快捷高效篩選鑒定轉(zhuǎn)化植株的方法，其利用一種轉(zhuǎn)入Ac/Ds轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽系統(tǒng)的農(nóng)桿菌進(jìn)行草莓轉(zhuǎn)化，并在擬轉(zhuǎn)化植株移栽后進(jìn)行巴龍霉素噴霧試驗(yàn)的方法，可以對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行快速篩選鑒定。

3.2 RNAi技術(shù)

RNAi又稱基因沉默，是一種應(yīng)用于基因研究的新技術(shù)。該技術(shù)可以在基因表達(dá)、調(diào)控與功能研究以及植物品種品質(zhì)改良中起到重要作用，為反向遺傳學(xué)研究提供了一條新的便捷途徑。近年來，RNAi技術(shù)在草莓基因功能與品質(zhì)改良方面的研究逐漸增多。Muňoz等[29]應(yīng)用RNAi技術(shù)證明了Fra a（一種編碼草莓過敏原蛋白的基因）在草莓類黃酮生物合成途徑中具有重要作用。Lin等[30]通過沉默F(xiàn)aDFR基因使得草莓果實(shí)顏色變淺，證明FaDFR基因是草莓果實(shí)花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵基因之一。同時(shí)，以RNAi理論為基礎(chǔ)而出現(xiàn)的VIGS（病毒誘導(dǎo)的基因沉默）也在草莓研究中得到應(yīng)用。Jia等[31]利用VIGS技術(shù)使FaNCED1以及一種ABA受體基因FaCHLH表達(dá)下調(diào)均能使草莓果實(shí)無法轉(zhuǎn)紅，但外源ABA處理能夠恢復(fù)FaNCED1下調(diào)的果實(shí)的著色卻不能使FaCHLH下調(diào)的果實(shí)顏色得到恢復(fù)，從而驗(yàn)證了ABA在果實(shí)成熟調(diào)控過程中起到重要作用。這都為草莓果實(shí)色素形成機(jī)理及品質(zhì)改良提供一定理論依據(jù)。

4 展望

綜上所述，現(xiàn)代生物技術(shù)在草莓遺傳育種研究中得到廣泛應(yīng)用并取得一定進(jìn)展。隨著生物技術(shù)方法的不斷創(chuàng)新，尤其是基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及蛋白組學(xué)等方面研究的不斷深入，現(xiàn)代生物技術(shù)將逐漸成為植物遺傳育種與品種改良的一種重要手段。但這些技術(shù)仍然存在一定的局限性，仍需大量深入研究而彌補(bǔ)缺陷。這主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：（1）組培誘導(dǎo)的草莓遺傳變異機(jī)理尚不明確，尤其是表觀遺傳變異機(jī)理研究仍需進(jìn)一步深入探討。（2）分子標(biāo)記在草莓上的應(yīng)用仍落后與其他多年生果樹，大多集中于質(zhì)量性狀研究。（3）草莓遺傳轉(zhuǎn)化效率低，穩(wěn)定性差，并且基因工程技術(shù)仍存在一定風(fēng)險(xiǎn)，轉(zhuǎn)基因安全性尚需深入研究。

因此，現(xiàn)代生物技術(shù)尚難取代常規(guī)育種技術(shù)在草莓遺傳育種中的地位，但是若將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)有效結(jié)合，比如利用新技術(shù)加快種質(zhì)創(chuàng)新與鑒定，加強(qiáng)分子標(biāo)記輔助選擇在常規(guī)育種中的應(yīng)用，建立安全、穩(wěn)定、高效的草莓遺傳轉(zhuǎn)化體系等，這將有效促進(jìn)草莓抗病、抗逆、優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、耐儲等育種目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，為草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展創(chuàng)造更多機(jī)遇。

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