陳蘭平等

摘 要 以甘蔗高糖品種福農(nóng)95-1702和低糖品種ROC-5為材料，分析SPS I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ在高、低糖這兩個品種的幼葉、第三功能葉和不同蔗莖的表達(dá)，測定甘蔗糖分積累早期、中期和后期的糖分含量。結(jié)果顯示，在功能葉和莖第二節(jié)中，三個階段SPS家族成員在高糖品種的含量整體趨勢高于低糖品種，結(jié)合蔗糖積累特點(diǎn)分析表明其可能在蔗糖合成中扮演著重要的角色。與正三葉相反，在幼葉中，三個階段SPS家族成員在高糖品種的表達(dá)量整體趨勢低于低糖品種，表明其可能與嫩葉的生長等其他生理性狀相關(guān)，在成熟莖中，隨著蔗糖積累時間的增加，高糖品種中的優(yōu)勢表達(dá)基因減少，而低糖品種中的優(yōu)勢表達(dá)基因增加，這可能與低糖品種中、后期大量積累蔗糖相關(guān)。

關(guān)鍵詞 甘蔗；蔗糖磷酸合成酶；家族成員；基因表達(dá)；實(shí)時熒光PCR

中圖分類號 Q946；S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Sucrose Phosphate Synthase（SPS）plays a key role for sucrose accumulation in plants. In the study， different tissues from three stages of sucrose accumulation in sugarcane cultivar FN95-1702 with high sugar content and ROC-5 with low sugar content， SPS gene expressions and sugar contents were investigated through RT-q-PCR and HPLC， respectively. The results showed that， in the mature leaves， except SPSⅡ， SPS genes presented significantly higher expression level in the 95-1702 than in ROC-5. Compared to low sugar content cultivar ROC-5， in most of tissues from high sugar content cultivar FN95-1702， SPSI exhibited a higher expression level for the middle stage of sucrose accumulation， SPSⅡ presented more abundant expression for the initial and middle stage of sucrose accumulation， and the expression of SPSⅢ was showed to be stable among the three stage of sucrose accumulation， SPSⅣ was observed to be lower in expression for initial stage of sucrose accumulation， SPSV had a lower expression for initial stage of sucrose accumulation. The results indicated that SPSV， SPSⅡand SPSⅣ contributed to the high sugar content for the initial， middle and final stage， respectively.

Key words Sugarcane； Sucrose phosphate synthase； Gene families； Gene expression； Real-time PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.018

蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate Synthase， SPS， EC 2.4.1.14）是蔗糖合成途徑中的關(guān)鍵酶，它催化UDPG（尿嘧啶核苷-5'-二磷酸葡萄糖）和F-6-P（果糖-6-磷酸）生成Su-6-P（蔗糖-6-磷酸）[1]。已有的研究結(jié)果表明，植物的SPS活性與蔗糖合成能力緊密相關(guān)[2-9]，是蔗糖合成途徑中的一個重要控制點(diǎn)。

在植物中，SPS是一個多個基因家族。前期，研究人員將高等植物SPS分為A、B、C 3個家族，這3個家族的成員在單、雙子葉植物中廣泛分布[10]。隨著水稻、玉米等禾本科作物的大規(guī)模基因組測序和EST序列測序結(jié)果的公布，依據(jù)更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)（如全長氨基酸序列、蛋白N端葡糖基轉(zhuǎn)移酶區(qū)、蛋白C端SPP相似區(qū)以及其酶蛋白結(jié)構(gòu)活性部位的氨基酸序列的相似性），對所有已知的SPS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，在禾本科植物中發(fā)現(xiàn)并界定了D家族（包括DⅢ和DⅣ）[11]，研究人員同時在小麥、水稻、玉米等禾本科植物中確定了5個SPS基因家族，分別用羅馬字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。其中家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ分別對應(yīng)于家族C、A、B，其實(shí)它們是家族C、A、B的亞家族；而家族Ⅲ、Ⅳ組成了新的D家族，并作為D家族的兩個亞家族而存在。以比較基因組和生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，預(yù)測甘蔗中存在A、B、C、D共4個家族5個SPS（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）基因[12]。

家族基因的表達(dá)特性分析對探討基因功能有重要意義，不同植物體內(nèi)SPS分布具有時空特異性，不同類型的基因發(fā)揮的功能亦存在差異。在煙草植株中存在A、B、C 3個家族的SPS，葉中主要分布SPSA和SPSC，通過RNAi技術(shù)抑制SPSA和SPSC的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺乏SPSC的情況下，淀粉不能被有效降解而合成蔗糖，這說明SPSC與淀粉降解后蔗糖的合成密切相關(guān)；但抑制SPSA沒有明顯的效果[13]。在禾本科植物中，研究發(fā)現(xiàn)不同家族SPS在不同作物中的分布也有差異。其中小麥、大麥等作物功能葉高表達(dá)SPSC，水稻、玉米、甘蔗成熟葉則優(yōu)勢表達(dá)SPSB，但它們的確切功能目前仍然未知。鑒于此，2004年，Castleden等[11]應(yīng)用Northern雜交分析不同生長期的小麥植株體內(nèi)SPS與SPP轉(zhuǎn)錄情況。2007年，Lutfiyya等[14]報道玉米植株體內(nèi)的7種SPS在不同組織不同生長環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在甘蔗中，定量PCR檢測成熟期葉片和莖中的SPS轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)表明，D家族基因的SPSⅢ、SPSⅣ在組織中表達(dá)量穩(wěn)定，其中SPSⅢ在不同的莖組織中表達(dá)量占SPS轉(zhuǎn)錄總量的三成以上，在所分析的莖組織和葉組織中表達(dá)量都高于SPSⅣ，這可能預(yù)示著SPSⅢ對甘蔗的蔗糖積累起著重要作用[15]。

在糖料作物甘蔗（Saccharum Spp.）中，探討SPS基因成員表達(dá)與糖分積累關(guān)系是解析甘蔗糖分積累機(jī)制的重要切入點(diǎn)。為此，在Grof C P L等[16]的研究基礎(chǔ)上，本研究分析SPS基因家族成員在高低糖甘蔗栽培種的幼葉、第三功能葉和不同蔗莖中的表達(dá)特征，測定甘蔗糖分積累早期、中期和后期的糖分含量，以期解析SPS家族成員表達(dá)特征與糖分積累關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗福農(nóng)95-1702和ROC-5由農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室育種組提供，均于2009年春季種植于福建農(nóng)林大學(xué)金山校區(qū)。在福建福州區(qū)域，甘蔗福農(nóng)95-1702和ROC-5兩個品種的糖分積累的早、中、后3個時期分別為10、11和12月。

1.1.2 主要試劑 Trizol購自Invitrogen公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）購自Sigma，PrimeScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）、DNA Marker均購自TaKaRa公司，DNaseⅠ購自Sigma，熒光定量PCR擴(kuò)增引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色譜法分析糖含量 采用Agilent Zorbax carbohydrate柱，以乙腈-水體積比為85 ∶ 15、80 ∶ 20、75 ∶ 25、70 ∶ 30的流動相測定糖混合標(biāo)準(zhǔn)品和甘蔗提取液中各種糖成分的含量和分離情況。具體參照逯平杰等[17]的方法進(jìn)行。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA合成 根據(jù)Trizol說明書提取蔗葉和蔗莖的總RNA，并用DNaseⅠ處理RNA中殘留DNA。cDNA合成按照Prime ScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）說明書操作。

1.2.3 甘蔗SPS家族基因表達(dá)量測定及表達(dá)差異分析 根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計原則使用Beacon Designer 7設(shè)計引物，同時結(jié)合參考文獻(xiàn)中引物設(shè)計[18-19]（引物序列如表1），以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）為內(nèi)參基因，使用ABI PrismR7300HT Fast Real-Time PCR儀器測定SPS表達(dá)量，以福農(nóng)95-1702未展開幼葉為校準(zhǔn)樣本，其他均為待測樣品，2-△△Ct法分析基因表達(dá)水平，比較各家族基因表達(dá)差異。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Spss17.0軟件對相同蔗莖中不同時期含糖量進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗福農(nóng)95-1702和ROC-5糖分積累早期、中期和后期的蔗糖含量分析

通過高效液相色譜法，分別測定了甘蔗福農(nóng)95-1702和ROC-5糖分積累早、中、后3個時期的4個不同部位莖節(jié)組織蔗糖含量，結(jié)果見圖1。甘蔗福農(nóng)95-1702在糖分積累各個時期糖分含量都高于ROC-5，福農(nóng)95-1702在蔗糖積累早期的第2、4、12、18節(jié)間中蔗糖含量分別比ROC-5蔗糖含量高189.28%、37.27%、53.98%、70.91%；在蔗糖積累中期的第2、4、12、18節(jié)間中蔗糖含量分別比ROC-5蔗糖含量高74.98%、3.72%、5.64%、3.71%，且蔗糖積累中期品種間蔗糖含量的差異明顯低于蔗糖積累早期；在蔗糖積累后期的第2、4、12、18節(jié)間中蔗糖含量分別比ROC-5蔗糖含量高26.00%、14.48%、10.64%、8.03%，兩品種間除莖2中蔗糖含量差距持續(xù)減小外，其余節(jié)間中蔗糖含量差距均再次擴(kuò)大。兩個甘蔗品種的蔗莖中蔗糖含量都隨著糖分積累時間增加而遞增。蔗糖積累后期，莖第4、12、18節(jié)在兩個品種蔗糖含量分別保持基本一致；蔗糖積累中期，莖第12、18節(jié)在兩個品種蔗糖含量分別無明顯差異，而莖4中蔗糖含量則明顯低于莖12、莖18。蔗糖積累早期，蔗糖含量除在ROC-5的莖12和莖18中保持一致外，在其余的莖節(jié)中蔗糖含量均隨著時間的遞增而增多，且莖12和莖18中蔗糖含量在ROC-5品種中積累明顯低于福農(nóng)95-1702品種，而在中期ROC-5蔗糖積累迅速增加，蔗糖積累后期增加速度又稍低于福農(nóng)95-1702品種，但3個時期ROC-5蔗糖含量始終低于福農(nóng)95-1702品種。

2.2 甘蔗糖分積累初期SPS家族基因的表達(dá)差異分析

甘蔗糖分積累初期，比較SPS家族成員在兩個品種中的表達(dá)特征，結(jié)果見圖2。SPSⅡ、SPSⅢ和SPSⅣ基因在兩個不同品種組織部位相對表達(dá)量差異均為極顯著（p<0.01），SPSⅠ基因在第18莖節(jié)相對表達(dá)量差異顯著（p<0.05），幼葉和莖在第2節(jié)中相對表達(dá)量差異極顯著（p<0.01），其它組織部位相對表達(dá)量差異不顯著（p>0.05）。SPSⅤ基因在兩個不同品種的蔗莖第9節(jié)中相對表達(dá)量差異不顯著（p>0.05），其它組織部位相對表達(dá)量差異極顯著（p<0.01）。

2.3 甘蔗糖分積累中期SPS家族基因的表達(dá)差異分析

甘蔗糖分積累中期，比較SPS基因成員在兩個品種的表達(dá)特征，結(jié)果見圖3，SPSⅠ基因在兩個不同品種的甘蔗組織部位中相對表達(dá)量差異均為極顯著（p<0.01）。SPSⅡ基因在兩個不同品種的甘蔗莖第9節(jié)、第18節(jié)相對表達(dá)量無顯著差異（p>0.05），其他組織部位均為相對表達(dá)量差異極顯著（p<0.01）。SPSⅢ基因在兩個不同品種的甘蔗幼葉和莖第14節(jié)中相對表達(dá)量差異顯著（p<0.05），其他組織部位均為相對表達(dá)量差異極顯著（p<0.01）。SPSⅣ基因在兩個不同品種的甘蔗莖第9、18節(jié)相對表達(dá)量差異顯著（p<0.05），其他組織部位均為相對表達(dá)量差異極顯著（p<0.01）。SPSⅤ基因在兩個不同品種的甘蔗莖第2、9節(jié)相對表達(dá)量差異顯著（p<0.05），其他組織部位均為相對表達(dá)量差異極顯著（p<0.01）。

2.4 甘蔗糖分積累后期SPS家族基因的表達(dá)差異分析

甘蔗在糖分積累后期，比較SPS基因成員在兩個品種的表達(dá)特征，結(jié)果見圖4，SPSⅠ基因在兩個不同品種的甘蔗幼葉中、SPSⅡ基因在兩個不同品種的蔗莖第9、18節(jié)相對表達(dá)量差異顯著（p<0.05），其它組織部位均為相對表達(dá)量差異極顯著（p<0.01）。SPSⅢ基因在兩個不同品種的甘蔗組織部位中相對表達(dá)量差異均為極顯著（p<0.01）。SPSⅣ基因在兩個不同品種的甘蔗莖第9節(jié)、SPSⅤ基因在兩個不同品種的甘蔗莖第2、9、18節(jié)相對表達(dá)量無顯著差異（p>0.05），其它組織部位均表現(xiàn)為相對表達(dá)量差異極顯著（p<0.01）。

2.5 甘蔗糖分積累不同時期SPS家族基因的相對表達(dá)量比較

比較SPS家族成員在甘蔗蔗糖積累早、中和后期同一組織部位不同家族成員的差異表達(dá)和同一成員在不同組織部位的差異表達(dá)，蔗糖積累早期家族基因表達(dá)特征如圖2和圖5所示，在同一組織部位不同家族基因在高、低糖品種甘蔗中的表達(dá)特征并不一致，在甘蔗未張開幼葉中，除SPSⅤ外，其他家族基因在低糖品種中優(yōu)勢表達(dá)。而在正三葉和莖不同節(jié)中SPS家族基因（除SPSⅣ）在高糖品種中的表達(dá)整體占優(yōu)勢地位，僅正三葉和莖第9、14節(jié)中SPSⅠ的表達(dá)在高、低糖品種中無顯著差異，莖第14節(jié)中SPSⅢ在低糖品種表達(dá)量高于高糖品種，莖第9節(jié)中SPSⅤ的表達(dá)在高、低糖品種間無顯著差異；SPSⅣ在不同組織部位的表達(dá)均為低糖品種占優(yōu)勢，而SPSⅤ在不同組織部位則基本為高糖品種優(yōu)勢表達(dá)，僅莖第9節(jié)中高、低糖品種間該基因表達(dá)無顯著差異，其他SPS家族成員在不同組織部位中的表達(dá)未表現(xiàn)出高、低糖品種間表達(dá)優(yōu)勢的一致性。

蔗糖積累中期家族基因表達(dá)特征如圖3和圖5所示，在正3葉中，所有家族基因都在高糖品種中相對表達(dá)量高于低糖品種，除SPSⅤ在低糖品種莖第2節(jié)的表達(dá)量高于高糖品種外，其余SPS家族成員在莖第2節(jié)表達(dá)優(yōu)勢特征與正3葉一致。在高糖品種的相對表達(dá)量高于低糖品種的SPS成員分別是甘蔗未張開幼葉中SPSⅢ、SPSⅣ家族基因，莖第9節(jié)中的SPSⅠ、SPSⅡ家族基因，莖第14節(jié)中的SPSⅠ、SPSⅢ，莖第18節(jié)中的SPSⅢ、SPSⅣ家族基因，其余組織部位對應(yīng)的基因表達(dá)特征與之相反，在低糖品種中優(yōu)勢表達(dá)；SPSⅠ除莖第18節(jié)中的表達(dá)在低糖品種高于低糖品種，其余均表現(xiàn)為高糖品種中表達(dá)優(yōu)勢，SPSⅤ葉組織中的表達(dá)在高糖品種中高于低糖品種，莖組織中與之相反，其它基因在高、低糖品種間不同組織中未表現(xiàn)出表達(dá)優(yōu)勢的趨勢性。

蔗糖積累后期家族基因表達(dá)特征如圖4和圖5所示，在甘蔗未張開幼葉中，所有家族基因都是在低糖品種中優(yōu)勢表達(dá)。正3葉中，僅SPSⅡ基因在低糖品種相對表達(dá)量高，其它家族基因均表現(xiàn)為在高糖品種優(yōu)勢表達(dá)。在蔗莖第2節(jié)，SPSⅠ、SPSⅡ基因在低糖品種的相對表達(dá)量高，SPSⅤ基因的相對表達(dá)量無顯著差異，SPSⅢ、SPSⅣ基因在高糖品種相對表達(dá)量高。在蔗莖第9節(jié)，SPSⅠ基因在低糖品種的相對表達(dá)量高，SPSⅢ基因表達(dá)情況則相反，SPSⅡ、SPSⅣ、SPSⅤ基因的表達(dá)量在高、低糖品種間無顯著差異。在蔗莖第14、18節(jié)，僅SPSⅣ基因在高糖品種的相對表達(dá)量高，其它家族基因的表達(dá)特征均表現(xiàn)為低糖品種占優(yōu)勢；除正3葉中的SPSⅠ在高糖中表達(dá)量高，莖第9節(jié)中的SPSⅡ在高、低糖品種間表達(dá)無顯著差異外，SPSⅠ和SPSⅡ在低糖品種中其余組織部位均為優(yōu)勢表達(dá)，其它基因在高、低糖品種間不同組織中未表現(xiàn)出表達(dá)優(yōu)勢的一致性。

整體而言，在蔗糖積累早期和中期SPS表達(dá)量在高糖品種中整體趨勢高于低糖品種，而在蔗糖積累后期則表現(xiàn)為相反的趨勢。3個時期中幼葉的SPS家族成員總體在低糖品種中高表達(dá)，正3葉的SPS家族成員總體在高糖品種中高表達(dá)，莖第2節(jié)與正3葉表現(xiàn)出高度一致的趨勢；其余莖節(jié)間無顯著的品種間優(yōu)勢表達(dá)趨勢。

3 討論與結(jié)論

甘蔗的功能葉片是光合作用和蔗糖合成的場所。在功能葉中，3個階段SPS家族基因表達(dá)量整體趨于高糖品種高于低糖品種，尤其在蔗糖積累中期所有SPS家族基因在高糖品種中的表達(dá)量均高于低糖品種，這可能與甘蔗功能葉片的蔗糖合成能力直接相關(guān)，其中SPSⅢ、SPSⅤ在蔗糖積累的不同時期在高糖品種的表達(dá)量均高于低糖品種，說明SPSⅢ、SPSⅤ與高糖品種的高蔗糖性狀緊密相關(guān)，可能在高糖品種的蔗糖合成中的整個過程中扮演重要的角色。蔗糖積累早期，SPSⅠ和SPSⅣ在高糖品種的表達(dá)量顯著低于低糖品種，而中、后期則相反，將這一結(jié)果結(jié)合高、低糖品種不同時期蔗糖含量進(jìn)行分析，在10～11月份期間低糖品種蔗糖積累速度明顯高于高糖品種，而11～12月份期間高糖品種的蔗糖積累速度又反超低糖品種，說明在蔗糖積累早期SPSⅠ和SPSⅣ在低糖品種表達(dá)量高的現(xiàn)象可能與隨后的低糖品種蔗糖積累迅速相關(guān)，而在蔗糖積累后期其在高糖品種表達(dá)量高的現(xiàn)象可能與隨后的高糖品種蔗糖積累迅速相關(guān)。兩種情況都表現(xiàn)出SPSⅠ和SPSⅣ的表達(dá)量與蔗糖積累的相關(guān)性，而蔗糖積累大部分來自葉片中的合成，表明SPSⅠ和SPSⅣ可能在蔗糖合成過程中扮演著至關(guān)重要的角色。在糖分積累后期，SPSⅣ、SPSⅤ基因在兩個不同品種中均表現(xiàn)為葉組織相對表達(dá)量偏高，莖組織相對表達(dá)量偏低，進(jìn)一步證明SPSⅣ和SPSⅤ在甘蔗葉片蔗糖合成中的重要作用。SPSⅡ在蔗糖積累早、中期在高糖品種的表達(dá)量顯著高于低糖品種，但后期則在低糖品種表達(dá)較高，并未表現(xiàn)出與高糖品種和低糖品種蔗糖積累能力的相關(guān)性，其可能僅在高糖品種蔗糖積累早、中期扮演重要的角色或者其余蔗糖含量關(guān)系無顯著相關(guān)性，其是否具有其他功能有待進(jìn)一步研究。

甘蔗的莖組織是糖分貯存的場所。前期的研究結(jié)果表明，SPSⅢ在不同的莖組織中表達(dá)量占SPS轉(zhuǎn)錄總量的三成以上，在所分析的莖組織和葉組織中表達(dá)量都高于SPSIV，這可能預(yù)示著SPSⅢ對甘蔗的蔗糖積累起著比SPSIV更為重要的作用[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)莖第2節(jié)的SPS家族成員在3個時期不同品種的表達(dá)模式與功能葉極為相似，可能由甘蔗嫩莖并非僅僅進(jìn)行蔗糖積累而且具有蔗糖合成能力的原因?qū)е?。而在莖第2節(jié)、第9節(jié)、12節(jié)、18節(jié)中，就整體而言，在蔗糖積累早期所有組織部位中，在高糖品種表達(dá)量高的基因有12個，低糖品種中優(yōu)勢表達(dá)的基因有5個；在蔗糖積累中期所有組織部位中，高糖品種中表達(dá)優(yōu)勢的基因有10個，低糖品種中優(yōu)勢表達(dá)的基因有10個；在蔗糖積累后期所有組織部位中，高糖品種中表達(dá)優(yōu)勢的基因有5個，低糖品種中優(yōu)勢表達(dá)的基因有10個。隨著蔗糖積累時間的增加，高糖品種中的優(yōu)勢基因減少，而低糖品種中的優(yōu)勢基因增加，這可能與低糖品種中后期大量積累蔗糖相關(guān)。結(jié)果說明，蔗糖磷酸合成酶對不同品種中蔗糖積累起著重要的作用，與前人的研究結(jié)果基本一致[20-24]。而前人對于SPSⅢ在蔗糖積累中的重要功能預(yù)測，本研究沒有驗(yàn)證結(jié)果。

本研究通過分析蔗糖磷酸合成酶基因各家族成員在高糖、低糖甘蔗生長的特定時期，不同部位的表達(dá)情況，分析蔗糖磷酸合成酶基因各家族成員在甘蔗生長過程中對糖分積累的影響，為研究SPS家族基因各成員在高糖、低糖甘蔗生長過程中對糖分積累的影響打下堅實(shí)基礎(chǔ)。下一步的研究，將對SPS家族基因及其啟動子進(jìn)行克隆和功能研究，為深入研究蔗糖磷酸合成酶與糖代謝的關(guān)系提供更明確的方向。

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