陳子健等

摘 要 以‘石硤龍眼果肉為材料，在（4±0.5）℃條件下貯藏，并將貯藏后期不同狀態(tài)果肉分為自溶與未自溶2部分，對(duì)其中的乙醇脫氫酶（ADH）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、細(xì)胞色素氧化酶（COD）、蘋果酸脫氫酶（MDH）、多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）、超氧物歧化酶（SOD）8個(gè)酶進(jìn)行同工酶電泳檢測(cè)，以果肉在貯藏過(guò)程中的變化為參照，對(duì)龍眼果肉自溶與同工酶變化的關(guān)系進(jìn)行探討。結(jié)果表明：“石硤”龍眼低溫貯藏過(guò)程中，整果果肉除POD外其余7個(gè)酶同工酶酶譜變化不大；但貯藏后期自溶果肉與未自溶果肉酶譜差異顯著，其中未自溶果肉與剛采收果肉（第0天）酶譜差異不大。說(shuō)明即使在同一果實(shí)中，自溶與未自溶果肉生理狀況明顯不同，龍眼采后果肉的生理變化主要集中在自溶果肉部分，未自溶的果肉基本維持與剛采收時(shí)相近的生理狀態(tài)。自溶與未自溶果肉中，APX、CAT、MDH、COD、PPD和POD酶譜條帶數(shù)目、種類以及表達(dá)量間差異顯著，這幾種酶可能與龍眼果肉的自溶有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞 龍眼（Dimocarpus longan Lonn.）；果肉自溶；同工酶；電泳

中圖分類號(hào) Q814 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The isozyme of alcohol dehydrogenase（ADH）， ascorbate peroxidase（APX）， catalase（CAT）， cytochrome c oxidase（COD）， malate dehydrogenase（MDH）， polyphenol oxidase（PPO）， peroxidase（POD） and superoxide dismutase（SOD） in Longan（Dimocarpus longan Lour cv.‘Shixia）pulp stored at 3-5 ℃ and divided into‘pulp-breakdownand‘intactat the end of storage were determined. The results showed that except the POD isozyme，the other 7 isozymes had a slightly changes in the band during storage of the pulp samples. But the bands of the breakdown pulp hada significant difference from those of the intact pulp which were similar to fresh pulp in 0 day. The results indicated that even in the same fruit pulp，there had a different physiology states between the breakdown pulp and the intact pulp. Postharvest physiology changes toke place mainly in the breakdown pulp of longan. The changes of amount，types and expression of APX， CAT， MDH， COD and POD isozymesbands indicated that these enzymes maybe associate closely with pulp-breakdown process of longan pulp.

Key words Longan；Pulp-breakdown；Isozyme；Electrophoresis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.031

采后龍眼鮮果難以保鮮，除了果皮的迅速褐變外，果肉的快速軟化、流汁和腐爛更為突出，其特征是果殼外觀看似完整，實(shí)際上內(nèi)部果肉已經(jīng)開(kāi)始溶解、流汁，趨于腐敗，這是龍眼果實(shí)在生命最后階段表現(xiàn)出來(lái)的相似癥狀，一些研究者又稱這種現(xiàn)象為“自溶”[1]。周云等[2]、梁漢華等[3]、韓冬梅等[4]、林河通等[5]分別對(duì)龍眼果肉自溶進(jìn)行了研究，但主要是對(duì)龍眼果肉自溶現(xiàn)象進(jìn)行描述，并提出了龍眼在貯藏中后期可能是先發(fā)生果肉的自溶后因微生物侵染而加速其腐敗的觀點(diǎn)，張強(qiáng)等[6]發(fā)現(xiàn)龍眼果肉衰老劣變與一些氧化還原酶及抗氧化能力的變化有密切關(guān)系。本研究探討了一些與衰老相關(guān)的氧化還原酶同工酶在龍眼果肉自溶過(guò)程中的變化，特別是對(duì)比同一果實(shí)的自溶果肉與未自溶果肉中這些酶同工酶的差異，以期為進(jìn)一步弄清龍眼果肉自溶機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以廣東省主栽優(yōu)質(zhì)龍眼品種“石硤”龍眼（Dimocarpus longan Lour.）果實(shí)為試驗(yàn)材料?！笆垺饼堁酃麑?shí)采自廣東省農(nóng)科院果樹(shù)研究所龍眼園。采收成熟度為8～9成熟，上午采摘的龍眼當(dāng)天運(yùn)回，剪下單果后，挑選出大小均勻，無(wú)病蟲害的果實(shí)用于試驗(yàn)，以0.3%含氯消毒劑清洗，晾干后，以0.02 mm厚的低密度聚乙烯袋（LDPE）包裝，每袋50個(gè)果，貯藏在（4±0.5）℃的恒溫箱（SANYO MIP-553）中。每7 d取樣一次，其中最后一天（49 d）取樣時(shí)，將果肉分成已自溶與未自溶2部分，以刀片對(duì)果肉進(jìn)行隨機(jī)切割取樣。所取果肉樣品，以液氮凍結(jié)徹底后用錫箔紙包好，放入自封袋中，存放于-40 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 電泳 電泳參考胡能書等[7]的方法，以不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠活性電泳法（Native-PAGE）對(duì)可溶性蛋白進(jìn)行分析。

1.2.2 乙醇脫氫酶（ADH）（E C 1.1.1.1） 粗酶制備參考李振國(guó)[8]的方法，略加修改，提取緩沖液為含5 mmol/L MgCl2和1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）的PBS（0.1 mol/L、pH7.5）。染色參照胡能書等[7]的方法，染色液組成：96 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L、pH8.0）（其中含NAD 40 mg、NBT 30 mg、PMS 3 mg），用時(shí)加入4 mL 95%乙醇，室溫避光染色，條帶呈藍(lán)紫色。

1.2.3 抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）（E C 1.11.1.11） 粗酶制備參考沈文飚等[9]的方法，略作修改，提取緩沖液為含0.1 mmol/L EDTA-Na2、2 mmol/L AsA的K2HPO4-KH2PO4緩沖液（50 mmol/L、pH7.0）。染色參照Mittlet等[10]的方法。

1.2.4 過(guò)氧化氫酶（CAT）（E C 1.11.1.6） 粗酶制備參考Chance等[11]的方法，提取緩沖液為50 mmol/L、pH7.0的PBS。染色參考孫彩霞等[12]的方法略作修改分3步進(jìn)行（1）將凝膠放在經(jīng)過(guò)預(yù)冷的1%淀粉溶液（置于沸水浴中至無(wú)色透明）中于4 ℃浸泡90 min（2）浸泡于0.3% H2O2中，室溫下靜置1 min后以雙蒸水漂洗（3）置于0.5%KI（每200 mL加入1 mL冰醋酸酸化）中浸泡染色。此法為負(fù)染，即酶帶為藍(lán)色背景中無(wú)色透明的條帶。

1.2.5 細(xì)胞色素氧化酶（COD）（E C 1.9.3.1） 粗酶制備參照夏濤等[13]的方法，略作修改，提取緩沖液為含5 mmol/L EDTA-Na2的50 mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。染色參照胡能書等[7]的方法，染色液體含1%二甲基對(duì)苯二胺、1%α-萘酚（溶于40%乙醇）和PBS（0.1 mol/L、pH7.4），三者以1 ∶ 1 ∶ 25（V ∶ V ∶ V）混合，室溫避光染色，條帶呈藍(lán)紫色。

1.2.6 蘋果酸脫氫酶（MDH）（E C 1.1.1.37） 粗酶制備參考?xì)W陽(yáng)光察[14]的方法，提取緩沖液為含10 mmol/L MgCl2和0.2 mmol/L EDTA的PBS（0.1 mol/L、pH7.5）。染色參考彭永康等[15]的方法，略作修改，染色液為100 mL PBS（0.1 mol/L、pH6.8），其中含NAD 30 mg、NBT 30 mg、PMS 3 mg、DL-蘋果酸250 mg，室溫避光染色，條帶呈藍(lán)紫色。

1.2.7 過(guò)氧化物酶（POD）（E C 1.11.1.7） 粗酶制備參照曾韶西等[16]的方法，略作修改，提取緩沖液為0.15 mol/L、pH7.0的PBS。染色參照沈德緒[17]的改良醋酸聯(lián)苯胺法。按次序?qū)?份2%醋酸-聯(lián)苯胺（1 g聯(lián)苯胺溶于9 mL熱的冰醋酸，再以水定容到50 mL）、1份4%NH4Cl 、1份5% EDTA、1份0.3% H2O2和8份雙蒸水混合成染色液，室溫下浸泡染色，條帶呈天藍(lán)色。

1.2.8 多酚氧化酶（PPO）（E C 1.10.3.1） 粗酶制備參照譚興杰等[18]的方法，略作修改，提取緩沖液為50 mmol/L、pH7.0的PBS。染色參照薛俊杰等[19]的方法，將10 mmol/L鄰苯二酚、0.01 %對(duì)苯二胺與PBS（50 mmol/L、pH6.8）以3 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V）混合后，室溫下浸泡染色，條帶呈紅棕色。

1.2.9 超氧化物歧化酶（SOD）（E C 1.15.1.1） 粗酶制備參考邵從本等[20]的方法，染色參照李中振等[21]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼果肉貯藏及自溶過(guò)程中ADH同工酶的變化

貯藏過(guò)程中各時(shí)間段樣品間以及與完整果肉的ADH同工酶間差異不大，而自溶果肉ADH條帶則明顯減弱（圖1）。3條同工酶譜帶中，以中間譜帶較穩(wěn)定，第1條譜帶變化較大。

2.2 龍眼果肉貯藏及自溶過(guò)程中APX、CAT、COD、MDH、PPO同工酶的變化

APX（圖2）、 CAT（圖3）、 COD（圖4）、 MDH（圖5）、 PPO（圖6）5種酶同工酶在不同貯藏期樣品間及其與完整果肉相比，其圖譜差異均不大，但自溶果肉的圖譜則與未自溶果肉樣品差異顯著，特別是APX、CAT和COD同工酶。說(shuō)明這些酶在龍眼果肉發(fā)生自溶的時(shí)候，其合成代謝及酶結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了明顯的變化。

2.3 龍眼果肉貯藏及自溶過(guò)程中POD同工酶的變化

POD同工酶在貯藏中，其條帶數(shù)量及表達(dá)強(qiáng)弱都發(fā)生變化，自溶果肉與未自溶果肉的POD同工酶圖譜差異顯著（圖7），說(shuō)明POD同工酶在龍眼低溫貯藏過(guò)程中一直變化，并且在果肉自溶中發(fā)揮作用。

2.4 龍眼果肉貯藏及自溶過(guò)程中SOD同工酶的變化

龍眼果肉中SOD同工酶較穩(wěn)定，所有樣品均只分離出3條酶帶，貯藏時(shí)間及是否自溶對(duì)酶帶的數(shù)量和強(qiáng)弱影響不大（圖8）。

3 討論與結(jié)論

龍眼果肉自溶是龍眼采后難以長(zhǎng)期貯藏的一個(gè)重要原因[4]，果肉的自溶導(dǎo)致果實(shí)喪失食用價(jià)值和商品價(jià)值。已有研究發(fā)現(xiàn)荔枝和龍眼果皮褐變與PPO和POD同工酶的變化有密切關(guān)系[22-24]，而對(duì)于果肉品質(zhì)劣變中這些酶同工酶的變化報(bào)道很少。本研究發(fā)現(xiàn)在龍眼果肉發(fā)生自溶后，APX、CAT、COD、MDH、PPO和POD酶同工酶也發(fā)生了較明顯的變化，表現(xiàn)在其酶帶數(shù)量和強(qiáng)弱的變化上，說(shuō)明它們與自溶的發(fā)生、發(fā)展有較密切的關(guān)系，但這些酶同工酶是導(dǎo)致果肉自溶的原因還是果肉自溶所引起的結(jié)果，還需作進(jìn)一步的研究。除POD外，貯藏過(guò)程中和貯藏后期未自溶果肉中的其余7種酶同工酶的酶譜與0 d的酶譜相似，在條帶數(shù)量與染色深淺上都沒(méi)有發(fā)生明顯變化，說(shuō)明低溫冷藏過(guò)程中，如果未發(fā)生果肉自溶，這些酶的性質(zhì)比較穩(wěn)定。在8種酶同工酶中，貯藏時(shí)間及果肉自溶與否對(duì)SOD同工酶均無(wú)明顯的影響，說(shuō)明龍眼果肉中SOD是一個(gè)較穩(wěn)定的酶，這與張強(qiáng)等[6]發(fā)現(xiàn)龍眼貯藏過(guò)程中果肉SOD活性變化很小的結(jié)果一致。Duan等[25]發(fā)現(xiàn)活性氧，特別是羥自由基的積累將促進(jìn)細(xì)胞壁多糖的降解，導(dǎo)致龍眼果肉的自溶。本研究結(jié)果表明當(dāng)果肉開(kāi)始發(fā)生自溶時(shí)，CAT等氧化還原酶的同工酶變化可能使組織中活性氧代謝和能量代謝出現(xiàn)異常，導(dǎo)致活性氧的積累，從而促使果肉組織的降解與崩潰，也即出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

綜合各同工酶電泳的結(jié)果可見(jiàn)，在龍眼自溶過(guò)程中，即使同一個(gè)果實(shí)里，自溶果肉與未自溶果肉的生理變化、代謝途徑都有很大差異，因此在進(jìn)行龍眼果肉自溶研究時(shí)，以整果果肉作為自溶進(jìn)程的生理分析并不能真實(shí)地代表自溶本身的變化，若將果肉的不同狀態(tài)分開(kāi)進(jìn)行研究，更有利于揭示龍眼果肉自溶的生理機(jī)理。

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