趙有璽　冀頤之　張慧娟　龔平

摘要[目的]優(yōu)化超氧化物歧化酶微膠囊的制備工藝，并對(duì)該微膠囊的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步的分析。[方法]采用水中干燥法制備超氧化物歧化酶微膠囊，并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化。利用掃描電鏡技術(shù)，分析超氧化物歧化酶微囊的表面形態(tài)及大小分布；并采用X射線光電子能譜和示差掃描熱量技術(shù)，初步研究超氧化物歧化酶微囊的結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]在最佳工藝條件下，超氧化物歧化酶微囊形狀規(guī)則，粒徑分布均勻。超氧化物歧化酶微膠囊是由乙基纖維素包裹超氧化物歧化酶成囊的，乙基纖維素與超氧化物歧化酶呈囊后，乙基纖維素與超氧化物歧化酶分子間形成很強(qiáng)的分子間相互作用。[結(jié)論]超氧化物歧化酶微囊的結(jié)構(gòu)分析，對(duì)進(jìn)一步研究微膠囊的控制釋放機(jī)制和改進(jìn)微囊性能具有一定的意義。

關(guān)鍵詞超氧化物歧化酶；微膠囊；X射線光電子能譜；示差掃描熱量

中圖分類(lèi)號(hào)S188；Q55文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）12-03483-03

基金項(xiàng)目北京市教委面上項(xiàng)目（KM201311417003）。

作者簡(jiǎn)介趙有璽（1979-），男，山東日照人，講師，碩士，從事工業(yè)微生物和酶制劑研究開(kāi)發(fā)工作。*通訊作者。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是一類(lèi)金屬蛋白酶類(lèi)，在生物體內(nèi)專(zhuān)一的清除氧自由基，保持生物體內(nèi)氧自由基的平衡，減少其對(duì)生物體的損害[1-2]。SOD廣泛存在于各種植物、微生物和動(dòng)物組織中。根據(jù)金屬輔因子的不同，SOD可以分為3類(lèi)：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD額Fe-SOD[3-5]。SOD在醫(yī)藥領(lǐng)域，食品工業(yè)，農(nóng)業(yè)上都有巨大的應(yīng)用潛力，是目前的研究熱點(diǎn)之一[6-13]。SOD在體外穩(wěn)定性差，受溫度、氧氣等因素影響容易失活，而且具有一定的免疫原性，這限制了其應(yīng)用[14-16]。微膠囊可以保護(hù)對(duì)氧、熱等因素敏感的組分，并具有控制釋放的功能[17-18]。因此，SOD的微膠囊化是解決上述問(wèn)題的有效途徑之一。

關(guān)于SOD微囊化的研究很少，文獻(xiàn)報(bào)道的只有龔平和朱俊晨開(kāi)展了SOD的微囊化研究，但只是關(guān)于微囊制備工藝的優(yōu)化研究，并未深入研究SOD微囊的結(jié)構(gòu)[16，19]。研究SOD微囊的結(jié)構(gòu)，對(duì)于了解微囊的控釋機(jī)制，進(jìn)一步改進(jìn)微囊的性能具有重要的意義。因此，筆者采用乙基纖維素在水中干燥法制備SOD微囊，對(duì)微囊的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)采用SEM、XPS和DSC等技術(shù)對(duì)制備的微囊進(jìn)行表征和分析，以期為分析微囊的表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。植物SOD干粉，購(gòu)自湖南沅江洪元植物葉蛋白開(kāi)發(fā)有限公司。

1.1.2主要儀器。日立S4800型掃描電鏡，購(gòu)自HITACHI公司；Thermo VG ESCALAB 250XPS，購(gòu)自Thermo VG 公司；Pyris I DSC，購(gòu)自Perkin Elmer公司。

1.1.3主要試劑。SDS，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；乙基纖維素（化學(xué)純）和二氯甲烷（分析純），市售。

1.2方法

1.2.1微膠的制備。微囊的制備工藝見(jiàn)參考文獻(xiàn)[16]。

1.2.2SOD微囊的表征。采用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)SOD微膠囊的微囊表面形貌、圓整度和孔性能進(jìn)行表征。

1.2.3SOD微囊的XPS 分析。采用張華安的方法[20]。

1.2.4SOD微囊的DSC分析。采用Perkin Elmer公司的Pyris I 型示差掃描量熱分析儀對(duì)SOD微囊、SOD和EC樣品進(jìn)行玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的熱分析。試驗(yàn)條件，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行，樣品質(zhì)量為13 mg，升溫速率10 ℃/min，測(cè)試溫度40～200 ℃，氣體流量20 ml/min。

2結(jié)果與分析

2.1SOD微膠囊的表征對(duì)制備好的SOD微囊，采用掃描電子顯微鏡（ SEM ） 對(duì)SOD微膠囊的微囊表面形貌、圓整度和孔性能進(jìn)行表征。圖1表明，SOD微囊，微囊圓整度均比較好，粒徑分布較為均一，微囊表面平滑，分布有相對(duì)均勻的小孔。

2.2X射線光電子能譜（XPS）對(duì)SOD微膠囊表面結(jié)構(gòu)的分析對(duì)囊芯物SOD、囊材物EC和SOD微囊進(jìn)行XPS全譜定性掃描，結(jié)果見(jiàn)圖2。通過(guò)譜圖可以看出，3個(gè)樣品中，被XPS檢出的主要元素是C和O。SOD微囊和SOD、EC的譜圖都不相同。這說(shuō)明，微囊表面的元素及分布與SOD和EC都不相同。圖1SOD微膠囊掃描電鏡結(jié)果注：A為SOD；B為EC；C為SOD微囊。

圖2XPS全譜分析 SOD的活性中心-Cu，是確定SOD微膠囊表面結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要元素。為了進(jìn)一步確定微囊表面結(jié)構(gòu)，試驗(yàn)進(jìn)行了Cu元素窄譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。只有SOD表面有銅元素檢出，EC和SOD微膠囊?guī)缀醪缓~元素，這說(shuō)明在SOD微膠囊中，SOD的活性中心是由EC包裹而不外露在微膠囊的表面。圖3SOD的Cu2p能圖譜對(duì)XPS分析得到的數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，結(jié)果如表1～2所示。表中主要列出了主要元素C、O、Cu的相對(duì)光電子流強(qiáng)度（cps）、結(jié)合能和結(jié)合能差值的數(shù)據(jù)。分析發(fā)現(xiàn)，微膠囊表面的氧元素與SOD表面的氧元素結(jié)合能值相差非常小，而與EC表面的氧元素結(jié)合能值相差較大，這表明其微膠囊表面氧的結(jié)構(gòu)與SOD近似。

由XPS的數(shù)據(jù)可知，SOD微膠囊表面幾乎不含銅元素，SOD的活性中心是由EC包裹在內(nèi)，而SOD微膠囊的表面氧的結(jié)構(gòu)與SOD近似。這說(shuō)明微膠囊內(nèi)的SOD的活性中心被EC包裹在內(nèi)，而極性基團(tuán)（羥基氧）會(huì)從微孔伸出，裸露在微膠囊表面，從而被XPS檢測(cè)出來(lái)。

2.3示差掃描熱量法（DSC）對(duì)SOD微囊內(nèi)部結(jié)構(gòu)分析為了分析SOD內(nèi)部結(jié)構(gòu)，對(duì)SOD，EC，SOD進(jìn)行DSC分析（圖4）。SOD沒(méi)有放熱峰，不存在玻璃化溫度Tg。EC在140.252 ℃有放熱峰，玻璃化溫度為177.846 ℃（圖4B）。SOD微囊在175.444 ℃存在一個(gè)平緩的放熱峰。

乙基纖維素由于帶有大量的極性基團(tuán)（羥基），通常以物理吸附或鍵合型式與水分子間產(chǎn)生相互作用。乙基纖維素在140.252 ℃有放熱峰，這是由于乙基纖維素與水結(jié)合的氫鍵被破壞所釋放出的熱量[21]。微膠囊形成過(guò)程中，乙基纖維素羥基是極性基團(tuán)，極性基團(tuán)之間會(huì)發(fā)生分子內(nèi)或分子間的相互作用，從而形成大量的氫鍵，同時(shí)SOD與乙基纖維素表1XPS數(shù)據(jù)分析

元素ECcpsEC結(jié)合能∥eVSODcpsSOD結(jié)合能∥eVSOD微囊-cpsSOD微囊結(jié)合能∥eVC117 088.40（Max.）285.17044 056.310（Max.）285.17879 430.77（Max.）284.92C44 254.17283.6408 877.197278.5005 4001.57286.70O182 454.50531.510374 145.800532.680192 722.40532.71Cu--4 311.425（Max.）935.930--Cu--3 423.976926.190--

分子之間形成較強(qiáng)的分子間相互作用，破壞這些氫鍵需要更高的能量及更長(zhǎng)的作用時(shí)間，因此對(duì)微膠囊進(jìn)行檢測(cè)時(shí)時(shí)候，放熱峰就會(huì)有所升高（圖4C），氫鍵的放熱峰與玻璃化轉(zhuǎn)變峰相互接近，形成一個(gè)部分相互疊加掩蓋，形成一個(gè)相對(duì)平緩的175.444 ℃放熱峰。這個(gè)溫度與乙基纖維素的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度近似一致，說(shuō)明該峰有可能和微膠囊的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度重合。由于SOD不存在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（圖4A），若其與乙基纖維素不產(chǎn)生化學(xué)變化，在成囊后，微膠囊的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度應(yīng)與乙基纖維素的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度相一致。這說(shuō)明乙基纖維素與SOD呈囊后，乙基纖維素確實(shí)與SOD分子間形成很強(qiáng)的分子間相互作用，但這種作用不是化學(xué)作用。

參考文獻(xiàn)

[1] CARILLON J，ROUANET J M，CRISTOL J P，et al.Superoxide dismutase administration，A potential therapy against oxidative stress related diseases：several routesof supplementation and proposal of an original mechanismof action[J].Pharm Res，2013， 30：2718-2728.

[2] KHALID H，HANIF M，HASHMI M A，et al.Copper complexes of bioactive ligands with superoxide dismutase activity[J].Mini Rev Med Chem，2013，13（13）：1944-1956.

[3] 馬偉榮，童軍茂，單春會(huì).超氧化物歧化酶的特征及在植物抗逆方面的研究[J]. 食品工業(yè)，2013，34（9）：154-157.

[4] 董亮，何永志，王遠(yuǎn)亮，等.超氧化物歧化酶的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2013，15（5）：53-58.

[5] 王占慶， 趙維娟，王金萍.超氧化物歧化酶同工酶基因多態(tài)性研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2012，21（16）：1884-1888.

[6] BAFANA A，DUTT S，KUMAR A，et al.The basic and applid aspects of superoxide dismutase[J].J Mol Catal B：Enzymatic，2011，68：129-138.