黃東梅 林妃 許奕 李羽佳 李艷霞 馬蔚紅 李敬陽

摘 ?要：以裸花紫珠無菌苗幼嫩莖段為外植體，研究不同激素配比下芽誘導(dǎo)、增殖和生根情況，獲得一套裸花紫珠快速繁殖的方法。結(jié)果表明：裸花紫珠幼嫩莖段誘導(dǎo)不定芽的最適培養(yǎng)基為MS+ 6-BA ? ? ?2.0 mg/L+ NAA 0.1～0.3 mg/L;不定芽在添加6-BA和NAA的各處理上均可增殖，在MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L上增殖系數(shù)最高、芽苗健壯;最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+ NAA 0.05 mg/L+ IBA 0.5 mg/L。此方法可為裸花紫珠快繁提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：裸花紫珠;組織培養(yǎng);快繁

中圖分類號：S567 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ?論文編號：2014-0577

Study on Fast Propagation via Tissue Culture for Callicarpa nudiflora

Huang Dongmei1， Lin Fei1， Xu Yi1， Li Yujia1， Li Yanxia1， Ma Weihong1，2， Li Jingyang1，2

（1Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement， Haikou Experimental Station/

Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 570102， Hainan， China;

2Seedlings Cultivation Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571737， Hainan， China）

Abstract： Using youngest stem of Callicarpa nudiflora as explant， the effects of different kinds and concentrations of plant grows regulator on shoot induction， proliferation and rooting were studied in order to get a unit of technology on fast propagation. Result showed that adventitious buds could be fast induced on medium MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1-0.3 mg/L， and the optimum proliferation medium was MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L+ GA3 0.5 mg/L， on which could get the highest proliferation rate and strongest shoots. Root could be induced best on medium 1/2MS+ NAA 0.05 mg/L+ IBA 0.5 mg/L. This method could provide technical support for large-scale propagation of Callicarpa nudiflora.

Key words： Callicarpa nudiflora Hook. Et Arn; Tissue Culture; Fast Propagation

0 ?引言

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. Et Arn），為馬鞭草科植物，是一種藥用、觀賞綠化兼用植物，植株高3～4 m，為灌木至小喬木，植株全株可入藥，味苦微辛性平，具有消炎、解毒、收斂、止血的功效[1]。裸花紫珠是海南省的主要道地藥材，備受重視，是海南省正致力于大力發(fā)展的南藥品種之一，已建成的國家中藥現(xiàn)代科技產(chǎn)業(yè)（海南）基地建設(shè)規(guī)劃中亦有提及裸花紫珠[2]，以裸花紫珠為原料制成裸花紫珠膠囊、裸花紫珠片等已在市場上銷售。

目前，國內(nèi)外學(xué)者們對裸花紫珠的研究主要集中在對其化學(xué)成分分析、療效的觀察和鑒定、藥劑制備等方面[3-4]，對其繁殖和增殖快繁研究較少[5]，目前市場對裸花紫珠的需求增大，而供給大部分依賴野生資源[7]，過度采用易使資源枯竭，因此很有必要加快對裸花紫珠繁育技術(shù)的研究。裸花紫珠傳統(tǒng)繁育中存在種籽結(jié)實率低、分株繁育和扦插繁育增殖系數(shù)小等問題[7-8]，宜積極研究其他再生技術(shù)如現(xiàn)代的組織培養(yǎng)等方法來擴大裸花紫珠繁殖的規(guī)模[9]。在本研究起步時，尚無關(guān)于裸花紫珠組織培養(yǎng)的文獻(xiàn)報道，本研究參考同科屬其他物種，設(shè)計不同培養(yǎng)基配方，對裸花紫珠芽誘導(dǎo)、芽增殖及生根誘導(dǎo)等進(jìn)行了優(yōu)化研究，以期獲得適宜裸花紫珠組織培養(yǎng)的條件，為通過組培快繁實現(xiàn)裸花紫珠的人工快速繁殖提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗時間、地點

研究田間試驗于2012—2013年在熱作兩院種苗組培中心進(jìn)行，室內(nèi)試驗在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實驗站熱帶種苗繁育中心進(jìn)行。

1.2 ?試驗材料

選取裸花紫珠無菌苗的幼嫩莖段作為外植體，裸花紫珠無菌苗由熱作兩院種苗組培中心提供。

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?不定芽誘導(dǎo) ?在超凈工作臺上，選取長勢良好、莖粗壯的枝條，小心切去頂芽、葉片，將莖切成1～2 cm的帶節(jié)小段，接種于附加不同濃度6-BA（0.5、1.0、1.5、 ? 2.0 mg/L）及NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）的MS培養(yǎng)基（白砂糖30 g/L，卡拉膠8 g/L，pH 5.8，下同）上，每個處理接種3瓶，每瓶5個外植體。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光周期16 h /8 h（光/暗培養(yǎng)），下同。觀察并記錄外植體出芽情況，篩選最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.3.2 ?增殖培養(yǎng) ?將誘導(dǎo)出的叢生芽分成大小相近的一小簇（約含3～5個小芽），轉(zhuǎn)至含有不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.1、0.3 mg/L）的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖壯苗培養(yǎng)，每個處理接種5瓶，每瓶3簇叢生芽。觀察并記錄芽生長增殖情況，篩選最佳增殖培養(yǎng)基。

1.3.3 ?生根培養(yǎng) ?不定芽經(jīng)過增殖壯苗長至2～3 cm后，將芽切下，轉(zhuǎn)至添加NAA（0.05、0.1 mg/L）和/或IBA（0.1、0.5、1.0 mg/L）的1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，每個處理接種5瓶，每瓶接4株，觀察并統(tǒng)計生根情況，篩選最佳生根培養(yǎng)基。

1.3.4 ?煉苗移栽 ?待組培苗健壯、根系發(fā)達(dá)、根長約4～5 cm后，將培養(yǎng)瓶打開瓶蓋，放置于溫室煉苗1周左右，取出生根苗用自來水清洗去掉根系上所粘附的培養(yǎng)基，栽入含有50%椰糠的基質(zhì)中，用保鮮膜覆蓋，每天定期噴水保濕，約1周后去掉保鮮膜進(jìn)行正常栽培管理。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不定芽的誘導(dǎo)

將裸花紫珠幼嫩莖段接種至12種芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，約20天后開始有新芽從節(jié)點長出，40天后出芽數(shù)劇增，統(tǒng)計各處理的出芽數(shù)并進(jìn)行顯著性比較（表1）。從結(jié)果可以看出，裸花紫珠幼嫩莖段在不同培養(yǎng)基上芽誘導(dǎo)率有所差異，且各處理組誘導(dǎo)率都在80%或以上，表明在MS培養(yǎng)基中添加適量的6-BA和NAA可以較好地誘導(dǎo)裸花紫出芽，激素濃度與芽的誘導(dǎo)率密切相關(guān)，其中在10號和11號培養(yǎng)基上，即MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1～0.3 mg/L上芽誘導(dǎo)率最高，誘導(dǎo)率100%，為裸花紫珠莖段最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.2 ?芽的增殖及壯苗

將叢生芽切割成大小近似的小塊，每塊約含有3～5個小芽，轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基，切割時注意將粘連的愈傷組織、枯死的葉片及不正常芽等切除掉以免影響生長繼而影響統(tǒng)計結(jié)果，約30天后可統(tǒng)計增殖情況，結(jié)果如表2所示，從結(jié)果可以看出，叢生芽在各處理的增殖培養(yǎng)基均能分化出不定芽，增殖系數(shù)大都在5～8以上，表明在基本培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA能促進(jìn)不定芽的增殖和分化。各處理的增殖系數(shù)和效果有差異，存在出芽快慢、長短、葉好壞之分，具體如圖1所示。通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計及觀察比較結(jié)果，4、5、6號培養(yǎng)基的增殖系數(shù)最高，不定芽幾乎鋪滿整個培養(yǎng)瓶，又以6號培養(yǎng)基的不定芽生長狀況最好，為最佳的增殖苗態(tài)，根據(jù)結(jié)果篩選出最佳增殖培養(yǎng)基為6號（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L），在此培養(yǎng)基上裸花紫珠增殖系數(shù)高、芽粗壯、植株健壯。

2.3 ?生根及移栽

將不定芽接到11種生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，培養(yǎng)10天左右芽基部開始出現(xiàn)萌動，15～20天左右開始有根長出，30天后根系基本上能達(dá)到4～5 cm。不同處理的根系生長情況如表3所示。不定芽在添加有NAA、IBA及2種組合的培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)生根，生根誘導(dǎo)率100%，表明低濃度的NAA和IBA均能促進(jìn)生根。但不同的培養(yǎng)基生根情況有差別，如處理1、2、3、4、6、11等處理誘導(dǎo)的根系較少，而處理5、7的根系則很旺盛;處理3、4、5處理誘導(dǎo)的根屬于細(xì)長型，對營養(yǎng)的吸收稍弱，植株亦較瘦弱，處理1、2、7、9、10等的根系則很粗，植株亦更粗壯，而處理12的根系雖然粗，但是有膨大的海綿體類組織，反而影響植株對營養(yǎng)的吸收繼而影響植株生長。根據(jù)觀察和統(tǒng)計結(jié)果，以 ? ? ? 1/2MS+ NAA 0.05 mg/L+ IBA 0.5 mg/L培養(yǎng)基上生根最好，根系生長快且粗壯旺盛，植株健壯，為最佳生根培養(yǎng)基。裸花紫珠組培苗經(jīng)過煉苗和移栽后，在基質(zhì)上成活率可達(dá)90%以上。

3 ?結(jié)論

迄今為止，裸花紫珠離體快繁技術(shù)在國外未見報道，國內(nèi)僅有潘梅等[10]1篇報道。本研究與該研究的目標(biāo)均為通過組織培養(yǎng)獲得裸花紫珠快速繁殖的方法，差別在于選用的外植體不一致。本研究的優(yōu)勢在于：（1）不需要經(jīng)過種子消毒發(fā)芽等過程，操作簡單;（2）通過莖段即可誘導(dǎo)出芽，而1棵植株可切分為多個莖段，相較種子繁殖系數(shù)更高。

選用基本培養(yǎng)基MS添加適量的6-BA和NAA可較好地誘導(dǎo)裸花紫珠幼嫩莖段產(chǎn)生不定芽，約20天即開始萌動產(chǎn)生芽點;40天可產(chǎn)生叢生芽;誘導(dǎo)率在80%以上，最適培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1～0.3 mg/L;不定芽在添加一定濃度的6-BA和NAA的MS基本培養(yǎng)基上均可增殖，30天后繁殖系數(shù)最高可達(dá)9以上，在培養(yǎng)基MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA ? ?0.3 mg/L上增殖系數(shù)最高、芽苗健壯;最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+ NAA 0.05 mg/L+ IBA 0.5 mg/L，生根誘導(dǎo)率100%。

4 ?討論

在植物的組織培養(yǎng)過程中，生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度是影響外植體誘導(dǎo)分化愈傷組織、不定芽、不定根的主要影響因子。筆者選用6-BA和NAA誘導(dǎo)裸花紫珠莖段產(chǎn)生不定芽，誘導(dǎo)率高達(dá)100%。觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同一6-BA濃度下隨著NAA的濃度提高出芽率呈一定的上升趨勢，但濃度過高出芽率又降低，表明低濃度的生長素對出芽有促進(jìn)作用，而高濃度的生長素反而抑制出芽;在同一NAA濃度下隨著6-BA濃度的上升出芽率也逐漸提升，表明6-BA越高越有利于細(xì)胞分化增殖，但也不是越高越好，尤其在增殖壯苗培養(yǎng)中高濃度的6-BA會引起不定芽葉片、莖和嫩梢膨大呈高度透明或半透明水浸狀，此即植株組織培養(yǎng)的玻璃化，當(dāng)不定芽呈現(xiàn)玻璃化，就很難繼續(xù)增殖和生長。

在本研究中，不定芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1～0.3 mg/L，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L，兩者的差別在6-BA濃度不一致，表明植物在組織培養(yǎng)的不同階段對細(xì)胞分裂素的要求不同，在某些特定階段可耐受較高的濃度并且需要較高濃度的細(xì)胞分裂素來促進(jìn)其分化生長，而在其他階段的培養(yǎng)中則不一定需要。

馬鞭草科植物組織培養(yǎng)中最常用的促進(jìn)不定芽生根的激素為NAA和IBA等[11-12]，筆者研究認(rèn)為NAA和IBA組合的培養(yǎng)基較單獨的NAA或IBA誘導(dǎo)生根更好，與李寬中等[13]研究結(jié)果一致;IBA濃度不是越高越好，高濃度的IBA對生根反而不利，猜測可能和IBA與一些酶互作影響酶活性進(jìn)而影響生根和伸長有關(guān)[14]，李麗淑等[15]研究同樣發(fā)現(xiàn)高濃度IBA對生根反而起抑制作用;此外，NAA的濃度也不能過高，NAA屬于效果比較強的生長素，低濃度時可以促進(jìn)生根，過高濃度容易使根系膨大成海綿根，不利于植物吸收營養(yǎng)，最終導(dǎo)致成活率低下，此結(jié)果與潘梅等[10]研究結(jié)果一致。

隨著市場對裸花紫珠的需求增高，對裸花紫珠繁殖等的研究亦會更熱門，本研究結(jié)果可為裸花紫珠快繁提供一定的技術(shù)支持。

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