華宇峰　劉京　王春臺(tái)　劉學(xué)群　譚艷平

摘要[目的]通過(guò)基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育（HLCMS）不育系粵泰A（YTA）中的2個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因orf216和orfH79的RNA，為Northern Blot檢測(cè)提供陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品，并可作為凝膠阻滯試驗(yàn)的底物，用于研究與恢復(fù)基因編碼產(chǎn)物的相互作用，從而為闡釋不育基因與恢復(fù)基因的相互作用分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。[方法]以紅蓮型胞質(zhì)雄性不育基因orf216和orfH79的特異引物，利用不育系YTA為材料，PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)片段，分別連接至pGEM-T Easy質(zhì)粒并篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定后酶切線(xiàn)性化，補(bǔ)平粘性末端，以rN4為底物、用依賴(lài)于DNA的 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase處理除去DNA模板，純化并測(cè)定RNA濃度，并用Northern Blot 驗(yàn)證。[結(jié)果]獲得了細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因orf216和orfH79各自的RNA，經(jīng)檢測(cè)orf216濃度為1.286 μg/μl，A260/A280為2.01；orfH79濃度為1.006 μg/μl，A260/A280為2.10。[結(jié)論]運(yùn)用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得的RNA片段條帶單一，純度較高，可用于體外大量獲取目的RNA。

關(guān)鍵詞水稻；紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育；體外轉(zhuǎn)錄；Northern Blot

中圖分類(lèi)號(hào)S511；Q37文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）12-03497-02

基金項(xiàng)目國(guó)家自然基金項(xiàng)目（31170296）。

作者簡(jiǎn)介華宇峰（1988- ），男，湖北黃岡人，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)研究。*通訊作者，副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，從事水稻功能基因方面的研究工作。

植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmic Male Sterile，CMS）現(xiàn)象在高等植物中普遍存在，是指植物雄性器官喪失功能，而雌性器官發(fā)育正常，表現(xiàn)為母性遺傳和花粉敗育的生物學(xué)現(xiàn)象[1]。Levings最早報(bào)道玉米CMS與細(xì)胞質(zhì)的線(xiàn)粒體基因組異常有關(guān)，并以此提出線(xiàn)粒體DNA是導(dǎo)致CMS產(chǎn)生的載體[2]。在大多數(shù)情況下，CMS植株花粉敗育的發(fā)生與線(xiàn)粒體基因組分子內(nèi)或分子間頻繁重組所形成的嵌合基因有關(guān)[3]，這種線(xiàn)粒體基因組的非正常重組產(chǎn)生嵌合開(kāi)放閱讀框最終導(dǎo)致了花粉敗育[4]。CMS導(dǎo)致的花粉敗育可以被恢復(fù)基因Rf所恢復(fù)。CMS/Rf系統(tǒng)減少了手工去雄的工作程序，因此，其在商業(yè)用雜交種子生產(chǎn)過(guò)程中就顯得尤為重要。CMS除了在農(nóng)業(yè)上的重要性之外，研究CMS的特性也為解析植物中線(xiàn)粒體基因和核基因在遺傳上的相互作用帶來(lái)了方便。

Boro II（BT）、Honglian（HL）和Wild abortive（WA）是主要的3種胞質(zhì)雄性不育類(lèi)型，均用于三系雜交水稻的培育[5]。易平等以atp6為探針，采用同源系列法，證明了HLCMS線(xiàn)粒體基因組中atp6orfH79構(gòu)成的嵌合基因與CMS有關(guān)[6]。liu等克隆了一個(gè)與HLCMS相關(guān)的基因片段HLsp1[7]。李丕順通過(guò)TAILPCR獲得HLsp1側(cè)翼序列，并預(yù)測(cè)其下游有一個(gè)編碼216個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框orf216[8]。陳為等發(fā)現(xiàn)orf216的表達(dá)能導(dǎo)致花粉敗育[9]。

體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)是在體外條件下合成RNA的過(guò)程。其基本原理是將目的基因片段連接到帶有噬菌體啟動(dòng)子的克隆載體下游，以構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA或其線(xiàn)性化片段為模板，用依賴(lài)于DNA的RNA聚合酶，在4種核糖核酸存在條件下，體外轉(zhuǎn)錄生成目的RNA?，F(xiàn)已成為一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于制備RNA，目前已經(jīng)有商業(yè)化的試劑盒銷(xiāo)售。應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄體系合成的單鏈RNA可用于研究RNA的加工、RNA結(jié)構(gòu)特性及其翻譯；還可用于合成RNA雜交探針，靈敏度極高，特異性強(qiáng)，優(yōu)于切口平移法獲到的探針[10]。筆者通過(guò)基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，獲得水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育（HLCMS）不育系粵泰A（YTA）中的2個(gè)雄性不育基因orf216和orfH79各自對(duì)應(yīng)的mRNA，以期為進(jìn)一步研究orf216的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。HLCMS不育系YTA植株和大腸桿菌DH5α，均由中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，克隆載體pGEMT Easy Vector，購(gòu)自Promega公司。

1.1.2主要試劑。限制性?xún)?nèi)切酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker和T4 DNA連接酶，購(gòu)自TAKARA公司；T4 DNA 聚合酶，購(gòu)自碧云天公司；DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自Axygen公司；SP6 RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自Promega公司；North2South？Biotin Random Prime Labeling Kit、North2South Chemiluminescent Hybridization和Detection Kit，均購(gòu)自Thermo scientific公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑分析純，市售。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)[6]。根據(jù)易平等發(fā)表的orfH79序列設(shè)計(jì)引物orfH79F/orfH79R，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室克隆的orf216序列設(shè)計(jì)引物orf216F/orf216R。引物由南京金斯瑞公司合成。

1.2.2載體構(gòu)建。取新鮮的水稻YTA葉片，用CTAB法提取基因組DNA，分別用orfH79和orf216的序列引物擴(kuò)增基因組DNA，獲得orfH79和orf216目的片段。將片段分別與克隆載體pGEMT Easy Vector 在體外進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于藍(lán)白斑篩選平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，SDS堿裂解法提取培養(yǎng)菌株質(zhì)粒DNA，并用PCR擴(kuò)增檢測(cè)其是否為陽(yáng)性，檢測(cè)為陽(yáng)性者送南京金斯瑞公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3體外轉(zhuǎn)錄。用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI將測(cè)序正確的質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA 聚合酶將粘性末端補(bǔ)平，再一次純化，得到可用于體外轉(zhuǎn)錄的線(xiàn)性質(zhì)粒DNA。按照SP6 RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配制體外轉(zhuǎn)錄體系，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，用RNasefree DNase消化模板質(zhì)粒DNA，純化產(chǎn)物，分別得到orfH79 mRNA和orf216 mRNA。nano drop儀（Thermo scientific公司，Nano Drop 2000）測(cè)定RNA濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA產(chǎn)物。

1.2.4Northern Blot檢測(cè)。應(yīng)用Northern Blot方法，利用生物素標(biāo)記的寡聚核苷酸作為探針，檢測(cè)所得到的RNA是否為特異的目標(biāo)RNA。

2結(jié)果與分析

2.1載體構(gòu)建以水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育（HLCMS）不育系粵泰A（YTA）為材料，利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增分別得到orfH79和orf216目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行特異引物PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性者送南京金斯瑞公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果均正確。

3討論

基因的體外轉(zhuǎn)錄體系現(xiàn)在已經(jīng)廣泛用于RNA的制備。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄，可以獲得多種RNA，包括SiRNA、tRNA及其他類(lèi)型的RNA，用于研究基因的表達(dá)調(diào)控，以及研究RNA的結(jié)構(gòu)和功能等。