王鈺婷 汪泰初 李瑞雪 王偉

摘 ?要：為了探尋一種高效、穩(wěn)定、廉價(jià)的桑蟥基因組DNA提取方法，通過(guò)采用CTAB法、蛋白酶K法和鹽析法3種方法研究桑蟥基因組DNA的提取。對(duì)提取的DNA進(jìn)行分光光度值的測(cè)定以及COI基因的擴(kuò)增鑒定。結(jié)果表明：3種方法均可以提取基因組DNA，蛋白酶K法和CTAB法DNA獲得率優(yōu)于飽和NaCl法提取的DNA，3種方法提取的DNA都可用于PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。因此，在實(shí)際工作中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、條件選取最適合的方法。

關(guān)鍵詞：桑蟥;DNA提取;CTAB法;蛋白酶K法;鹽析法

中圖分類號(hào)：S-186 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ?論文編號(hào)：2014-0684

Comparison of Three Methods for Genomic DNA Extraction from the Rondotia menciana Moore

Wang Yuting， Wang Taichu， Li Ruixue， Wang Wei

（The Sericultural Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Science， Hefei 230061， Anhui， China）

Abstract： To explore an efficient， stable， low-cost DNA extraction method from Rondotia menciana Moore， genomic DNA was extracted using CTAB， protein enzyme K and salting-out method， respectively. The extracted genomic DNA samples of three methods were tested using photometric analysis and COI gene amplification. The results showed that， all the three methods can be used for the total DNA extraction， which are suitable for the PCR amplification， but genome DNA extracted by CTAB method and protein enzyme K method were higher in purity and production， degraded slightly. So we should select the proper method according to the objective and condition in the study.

Key words： Rondotia menciana Moore; DNA Extraction; CTAB Method; Protein Enzyme K Method; Salting-out Method

0 ?引言

桑蟥（Rondotia menciana Moore）是桑樹(shù)芽葉的重要害蟲(chóng)之一。鱗翅目、蠶蛾科，別名桑蠶、白蠶、白蟥、松花蠶等。桑蟥分布于安徽、江蘇、浙江、山東、河南、河北、山西、陜西、甘肅、湖南、湖北、江西、四川、廣東及東北各省。寄主主要為桑樹(shù)，被侵害的桑樹(shù)滿葉蟲(chóng)孔，蟥繭累累，葉黃如麻，嚴(yán)重影響秋蠶生產(chǎn)，是重要的國(guó)際性檢疫害蟲(chóng)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，從DNA水平對(duì)昆蟲(chóng)進(jìn)行物種分類鑒定、遺傳多樣性分析、探討系統(tǒng)發(fā)育、進(jìn)一步研究物種起源與進(jìn)化已成為現(xiàn)代昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究熱點(diǎn)[1]。而獲得高質(zhì)量的基因組DNA是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本需要，是進(jìn)行分子標(biāo)記、基因克隆及基因表達(dá)研究等下游技術(shù)的必要前提。因此尋求簡(jiǎn)便、快速、有效的DNA提取方法，對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)展分子生物學(xué)研究具有十分重要的意義[2]。

劉波等[3]用CTAB法成功提取了稻蝗昆蟲(chóng)的干標(biāo)本和酒精浸泡標(biāo)本DNA。榮萬(wàn)韜等[4]用蛋白酶K法對(duì)單條線蟲(chóng)的基因組進(jìn)行提取，探尋到一種高效穩(wěn)定的DNA提取方法。張拓等[5]用比較了4種大豆蚜基因組DNA提取方法，結(jié)果證明鹽析法能夠更快速有效的提取大豆蚜基因組DNA。目前，對(duì)于昆蟲(chóng)基因組DNA提取研究較少，僅限于雙翅目、直翅目中的一些昆蟲(chóng)[6]，關(guān)于鱗翅目昆蟲(chóng)基因組DNA提取的研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。筆者采用3種昆蟲(chóng)基因組DNA提取的常用方法，即CTAB法、蛋白酶K法和鹽析法稍作改進(jìn)，以桑蟥為研究材料，通過(guò)基因組DNA OD260/280值、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，比較了3種方法提取的基因組DNA的質(zhì)量，旨在為進(jìn)一步深入開(kāi)展其親緣關(guān)系分析、基因組比較、遺傳多態(tài)性和某些特定基因的標(biāo)記等分子生物學(xué)研究提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 ?材料與方法

選用3種不同方法從桑蟥幼蟲(chóng)中提取基因組DNA，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳來(lái)檢測(cè)提取的DNA的純度和濃度。

1.1 ?材料

桑蟥，2013—2014年間采集于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所的桑園內(nèi)，經(jīng)專家鑒定后用95%乙醇浸泡，放置于-20℃冰箱中保存。

1.2 ?桑蟥基因組DNA抽提方法

1.2.1 ?CTAB法 ?參照劉佳妮等[7]的方法，稍加改進(jìn)。

（1）將單頭桑蟥幼蟲(chóng)置于1.5 mL離心管中，加入400 ?L 2% CTAB提取緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% CTAB）， ? ?-20℃放置10 min。充分研磨， 勻漿;（2）65℃水浴2 h，其間輕輕混勻2次，4℃ 10000 r/min離心15 min;（3）取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提，混勻，10000 r/min離心10 min，取上清，反復(fù)抽提2次;（4）75%乙醇漂洗沉淀2次，無(wú)水乙醇漂洗，室溫干燥，使乙醇揮發(fā)干凈。（5）加入30 μL滅菌ddH2O，充分溶解后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?蛋白酶K法 ?參照其他的昆蟲(chóng)提取方法[8-9]加以優(yōu)化改進(jìn)。

（l）取單頭昆蟲(chóng)放在1.5 mL離心管中，加入100 ?L DNA裂解液（100 mmol Tris-HCL （pH 8.0），25 mmol EDTA （pH 8.0），500 mmol NaCL，1% SDS）。研磨，用400 ?L裂解液沖洗研磨棒。（2）加入蛋白酶K至終濃度100 ?L/mL，45℃水浴1 h，加入RNase A至終濃度20 ?L/mL，水浴15 min。（3）等體積苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）、氯仿：異戊醇（24：1）分別抽提一次，14000 r/min離心10 min。（4）取上清，加入2.5倍體積無(wú)水乙醇，14000 r/min離心10 min。（5）75%乙醇漂洗沉淀2次，無(wú)水乙醇漂洗，室溫干燥，使乙醇揮發(fā)干凈。（6）加入30 μL滅菌ddH2O，充分溶解后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ?鹽析法 ?參照Sunnucks等[10]的方法，稍加改進(jìn)。

（1）將單頭桑蟥幼蟲(chóng)置于1.5 mL離心管中，加入20 μL DNA提取緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，1% SDS）研磨。（2）加入200 μL DNA提取緩沖液和6 μL蛋白酶K（20 mg/mL），充分混勻，置于60℃水浴1 h，中間取出混勻 ?2次。（3）加入80 μL 5 mol/L NaCl，充分振蕩15 s，4℃ 10000 r/min離心15 min，沉淀蛋白質(zhì)，取上清液于另一離心管中。（4）加入2倍體積的冰凍無(wú)水乙醇，上下顛倒5次，至溶液徹底混勻，-20℃放置1 h。（5）4℃ 14000 r/min離心10 min，棄上清液。（6）加入300 μL預(yù)冷的75%乙醇，4℃ 10000 r/min離心15 min;將管口向下讓DNA自然干燥。（7）加入30 μL滅菌ddH2O，充分溶解后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ?濃度和純度的檢測(cè)

1.3.1 ?瓊脂糖凝膠電泳 ?采用穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-Ⅲ2型）和STS型紫外透射分析儀。其中瓊脂糖的濃度為1.0%，電壓為100 V，電泳時(shí)間為40 min。

1.3.2 ?紫外分光光度計(jì)檢測(cè) ?采用日本分光株式Jasco公司（V-560型）的紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定這3種方法提取的基因組DNA在260、280 nm處的吸收值，并根據(jù)OD260/280計(jì)算其純度。產(chǎn)量計(jì)算公式為[dsDNA]=50×OD260×稀釋的倍數(shù)。

1.3.3 ?PCR ?擴(kuò)增比較不同的模板DNA ?PCR擴(kuò)增引物采用Chris Simon等[11]發(fā)表的昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)編碼細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（COI）基因通用引物，上游引物C1-J-1718：5'-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3'和下游引物C1-N-2191：5'-CCCGGTAAAATTAAAATAT AAACTTC-3'。引物由寶生物（大連）工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Thermo Hybaid PCR儀上進(jìn)行。PCR的反應(yīng)體系為50 μL。內(nèi)含10×反應(yīng)緩沖液， ? ?2.5 mmol/L dNTP，25 mmol/L Mg2+，上下游引物各為20 pmol/μL，5 U/μL Taq酶，DNA模板50 ng，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min;循環(huán)周期依次為94℃變性40 s，47℃退火40 s，72℃延伸1 min;35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，72℃延伸10 min。為驗(yàn)證PCR的可重復(fù)性和一致性，用同樣的反應(yīng)體系和程序重復(fù)3次，至結(jié)果穩(wěn)定。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

分別將3種方法提取的DNA在1%瓊脂糖上電泳，結(jié)果如圖1所示。3種方法都能成功提取到桑蟥基因組DNA（圖1）。

2.2 ?PCR擴(kuò)增效果檢測(cè)

將3種方法所提DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，效果如圖2所示。3種方法抽提的DNA都能得到高效擴(kuò)增，擴(kuò)增效果無(wú)明顯差異。

2.3 ?3種提取方法比較

DNA純度的判斷根據(jù)OD260/280的比值判斷，符合要求純度高的DNA其OD260/280≈1.8。若OD260/280<1.6，說(shuō)明樣品中存在蛋白質(zhì)，應(yīng)再用氯仿/異戊醇抽提，以乙醇沉淀純化DNA;若OD260/280>1.9，說(shuō)明DNA中含有RNA，可考慮用RNA酶處理樣品[12]。本實(shí)驗(yàn)中蛋白酶K法和CTAB法電泳檢測(cè)點(diǎn)樣孔干凈，主帶清晰整齊，無(wú)拖尾現(xiàn)象，DNA獲得率都在50 ng/μL以上，PCR擴(kuò)增效果較好。提取的DNA樣品在OD260/280的吸光值均在1.6～1.9之間，說(shuō)明得到的DNA比較純凈，蛋白質(zhì)、多糖及酚類雜質(zhì)去除的比較完全;飽和NaCl法提取的DNA電泳后條帶不太規(guī)整，有明顯的降解，說(shuō)明提取的DNA不太純凈，樣品OD260/280都小于1.6，說(shuō)明提取的DNA可能夾雜著蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，純度不高。

3 ?結(jié)論與討論

DNA提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，制備完整的、純度高的核酸是進(jìn)一步試驗(yàn)的關(guān)鍵因素。所以，總DNA的提取作為起始步驟是分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)和前提。但是昆蟲(chóng)種類繁多、形態(tài)結(jié)構(gòu)千差萬(wàn)別，不同生物的基因組DNA需要采取不同的提取方法，但主要的步驟都包括破膜釋放DNA、抑制核酸酶和除去蛋白質(zhì)與其他大分子等。在核酸提取的過(guò)程中仍存在著很多困難，如DNA含量相對(duì)較少，分離難度大，易被降解等。由于昆蟲(chóng)個(gè)體較小，其核酸含量就更少，提取工作更加困難，因此，選取適合的DNA提取方法至關(guān)重要[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)比較分析了3種桑蟥基因組DNA提取方法，利用CTAB法提取桑蟥DNA，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)短，不需要昂貴的儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)藥品，易于在一般的實(shí)驗(yàn)室里完成整個(gè)操作。而蛋白酶K法相對(duì)于CTAB法，所需試劑價(jià)格較昂貴，成本較高。在實(shí)驗(yàn)時(shí)間充裕的情況下，可以從這2種方法中選擇;鹽析法操作簡(jiǎn)單連貫，不使用苯酚、氯仿、異戊醇等有毒試劑，但是降解較嚴(yán)重，產(chǎn)率較低，純度較差，3種方法提取的DNA均可用于PCR擴(kuò)增。因此可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件選擇使用。

根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，已有很多提取昆蟲(chóng)DNA的方法，但是至今未發(fā)現(xiàn)一種通用的方法[15]，不同生物DNA的提取方法不盡相同，但各種提取方法也有很多相通之處，可以相互借鑒。當(dāng)然隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，各種簡(jiǎn)潔、高效的DNA提取方法也會(huì)不斷的創(chuàng)新出現(xiàn)，相信這些方法在不斷的優(yōu)化后可以更好地應(yīng)用于鱗翅目昆蟲(chóng)的基因提取實(shí)驗(yàn)[16]。

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