張丹　陳增菊　李謹(jǐn)謹(jǐn)　李小鵬　曹傳旺

摘要[目的]研究3種農(nóng)藥對(duì)花翅搖蚊毒力和AChE活性影響。[方法]以花翅搖蚊為對(duì)象，測(cè)定氧化樂果、甲萘威和辛硫磷對(duì)花翅搖蚊4齡幼蟲毒力和體內(nèi)AChE活性的影響。[結(jié)果]氧化樂果、甲萘威和辛硫磷24 h 致死中濃度LC50分別為193.45、73.53和100.30 mg/L。亞致死濃度（LC5、LC10和LC20）脅迫下，氧化樂果和甲萘威對(duì)搖蚊幼蟲AChE活性抑制率分別為-9.03%～5389%和514%～3814%，主要表現(xiàn)為抑制作用。辛硫磷對(duì)AChE活性抑制率為-27.27%～33.13%。[結(jié)論]搖蚊幼蟲AChE對(duì)3種農(nóng)藥有高敏感性，可作為監(jiān)測(cè)水體農(nóng)藥污染的生化標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞花翅搖蚊；農(nóng)藥；乙酰膽堿酯酶；毒力；活性

中圖分類號(hào)S481+.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）12-03565-03

基金項(xiàng)目中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金項(xiàng)目（2572014CA10）；東北林業(yè)大學(xué)本科生創(chuàng)新項(xiàng)目（201310225090）。

作者簡(jiǎn)介張丹（1992- ），女，吉林白城人，本科生，專業(yè)：森林保護(hù)。*通訊作者，副教授，從事昆蟲毒理學(xué)研究。

近年來化學(xué)農(nóng)藥已成為水體環(huán)境的主要污染物之一。目前，對(duì)于水體污染的監(jiān)測(cè)主要通過化學(xué)分析方法，而這并不能直觀地反映污染物對(duì)機(jī)體的毒性作用[1]。生物標(biāo)志物是生物體受到嚴(yán)重?fù)p害之前，在不同生物學(xué)水平（分子、細(xì)胞、個(gè)體等）上因受環(huán)境污染物影響而異?；男盘?hào)指標(biāo)[2]，尋找和發(fā)現(xiàn)敏感性生物標(biāo)志物已成為研究的熱點(diǎn)[3]。研究表明，乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的作用靶標(biāo)，被廣泛用于特異性生物標(biāo)志物來監(jiān)測(cè)該類有機(jī)化合物[4]。

筆者以花翅搖蚊（Chironomus kiinensis）為模式生物，在研究農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用的氧化樂果、甲萘威和辛硫磷對(duì)搖蚊4齡幼蟲急性毒性基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究3種亞致死濃度農(nóng)藥對(duì)AChE活性影響效應(yīng)，旨在探討AChE對(duì)農(nóng)藥的敏感性，為進(jìn)一步開發(fā)用于監(jiān)測(cè)常用農(nóng)藥污染的生物化學(xué)標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx花翅搖蚊（Chironomus kiinensis）初始種群來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生理與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，于室內(nèi)用暴氯3 d的自來水（pH 7.58；溶解氧6.02 mg/L；總硬度80 mg/L），水溫（25±1）℃，自然光照飼養(yǎng)，馴化3 d后挑選健壯、大小一致的4齡幼蟲用于試驗(yàn)。

1.2供試農(nóng)藥與試劑82.8%氧化樂果原油（鄭州沙隆達(dá)偉新農(nóng)藥有限公司）；95%甲萘威（南開大學(xué)農(nóng)藥國(guó)家工程研究中心）；90%辛硫磷（南開大學(xué)農(nóng)藥國(guó)家工程研究中心）；碘化硫代乙酰膽堿（ATCh）、二硫雙對(duì)硝基苯甲酸（DTNB）、考馬斯亮藍(lán)G250等均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；牛血清蛋白（BSA）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸和乙醇等購(gòu)于天津永大化學(xué)試劑有限公司。

1.3搖蚊毒性測(cè)定及致毒處理采用藥液培養(yǎng)法進(jìn)行毒性測(cè)定[5]。將氧化樂果、甲萘威和辛硫磷丙酮母液用蒸餾水分別配成系列濃度梯度，以蒸餾水為空白對(duì)照，將健壯、大小一致的花翅搖蚊4齡幼蟲放入盛有50 ml藥液的透明塑料杯中，每處理20頭，3個(gè)重復(fù)，于24 h后統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)，以探針觸動(dòng)搖蚊尾部不動(dòng)彈視為死亡。另將健壯、大小一致花翅搖蚊4齡幼蟲分別放入亞致死濃度（LC5、LC10和LC20）氧化樂果、甲萘威和辛硫磷藥液中，致毒處理6、12、24和48 h后取樣，隨機(jī)挑取活潑的幼蟲20頭，蒸餾水潤(rùn)洗，冷凍于-80 ℃冰箱中用于蛋白質(zhì)含量和AChE活性測(cè)定。

1.4乙酰膽堿酯酶（AChE）活性測(cè)定AChE活性測(cè)定參考GORUN等[6]改進(jìn)的Ellman方法。取0.2 ml不同稀釋濃度的待測(cè)酶液與0.6 ml ATCh混勻后，35 ℃水浴10 min，再加入2.0 ml DTNB顯色劑（含40%乙醇）終止反應(yīng)，于412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值，通過下列公式計(jì)算AChE比活力。

1.5數(shù)據(jù)分析采用POLO軟件計(jì)算農(nóng)藥對(duì)搖蚊幼蟲致死中濃度LC50和亞致死濃度（LC5、LC10和LC20）及95%置信區(qū)間。運(yùn)用GraphPad InStat軟件對(duì)同一時(shí)間處理下不同濃度對(duì)AChE活性影響差異采用Tukey方法進(jìn)行比較分析（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.13種農(nóng)藥對(duì)搖蚊幼蟲毒力氧化樂果、甲萘威和辛硫磷對(duì)花翅搖蚊4齡幼蟲毒力見表1。由表1可知，氧化樂果、甲萘威和辛硫磷對(duì)幼蟲24 h致死中濃度LC50分別為193.45、73.53和100.30 mg/L，毒力大小為甲萘威>辛硫磷>氧化樂果，說明3種常用農(nóng)藥對(duì)花翅搖蚊均具有較高生物活性。

2.23種農(nóng)藥對(duì)搖蚊AChE活性影響氧化樂果對(duì)搖蚊幼

3結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明，有機(jī)磷類農(nóng)藥氧化樂果、辛硫磷對(duì)花翅搖蚊4齡幼蟲24 h LC50高于氨基甲酸酯類農(nóng)藥甲萘威，這說明搖蚊幼蟲對(duì)甲萘威具有高敏感性。為了進(jìn)一步探討農(nóng)藥對(duì)搖蚊的毒性機(jī)制及搖蚊AChE作為監(jiān)測(cè)水體早期農(nóng)藥污染的生物標(biāo)志物的可能性，該研究測(cè)定了3種農(nóng)藥對(duì)搖蚊AChE活性影響。AChE是神經(jīng)遞質(zhì)酶，通過水解乙酰膽堿保證神經(jīng)信號(hào)的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。有機(jī)磷與氨基甲酸酯類的結(jié)構(gòu)與乙酰膽堿的結(jié)構(gòu)相似，能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合AChE活性位點(diǎn)，從而抑制AChE活性。亞致死濃度（LC5、LC10和LC20）甲萘威對(duì)搖蚊體內(nèi)AChE活性表現(xiàn)為抑制作用，抑制率為5.14%～38.14%，抑制作用最大的是24 h LC5處理組；隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，甲萘威對(duì)AChE活性的抑制作用呈現(xiàn)低—高—低的趨勢(shì)。儀美芹等[9]研究發(fā)現(xiàn)，滅多威、硫雙滅多威、克百威及丁硫克百威4種氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)鯽魚腦AChE有強(qiáng)烈的抑制作用，且存在較好的劑量關(guān)系。氧化樂果脅迫下，搖蚊幼蟲AChE活性主要表現(xiàn)為抑制作用，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，AChE活性抑制作用呈增加趨勢(shì)。葛士林等[10]研究發(fā)現(xiàn)，亞致死濃度的氧化樂果脅迫下，紅裸須搖蚊（Propsilocerus akamusi）幼蟲體內(nèi)AChE的活性均被抑制，脅迫時(shí)間越長(zhǎng)抑制作用越大，與該研究結(jié)果基本一致。搖蚊幼蟲暴露在亞致死濃度（LC5、LC10和LC20）辛硫磷24 h內(nèi)，AChE的活性主要被誘導(dǎo)激活；脅迫48 h搖蚊AChE主要表現(xiàn)為抑制，這表明短時(shí)間內(nèi)搖蚊體內(nèi)其他解毒酶系參與了代謝過程。如短時(shí)間內(nèi)酯酶（如：脂族酯酶）可作為有機(jī)磷農(nóng)藥的替代靶標(biāo)，對(duì)真正的靶標(biāo)AChE起到一定保護(hù)作用[3]，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，這種保護(hù)作用可能減弱而AChE則被抑制。有關(guān)AChE對(duì)微量有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥脅迫具有很高的敏感性，這些研究已在老鼠、昆蟲、魚類、甲殼類動(dòng)物等的體內(nèi)和體外試驗(yàn)中得到證實(shí)[9-14]?；ǔ釗u蚊AChE對(duì)氨基酸甲酯類農(nóng)藥甲萘威、有機(jī)磷類農(nóng)藥氧化樂果和辛硫磷的脅迫均作出應(yīng)答響應(yīng)，為合理評(píng)價(jià)農(nóng)藥的水體污染提供了一定的科學(xué)參考，而3種農(nóng)藥對(duì)AChE分子作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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