黃世臣　 趙敏

摘要

[目的]為了獲得B.bipolaris HD1膽紅素氧化酶純品，確定酶的同源性及其常規(guī)酶學性質(zhì)。[方法]將B.bipolaris HD1發(fā)酵液依次通過硫酸銨鹽析、陰離子交換層析和凝膠過濾層析確定蛋白的純度、濃度和酶活力；通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF）法獲得氨基酸序列，并利用Mascot軟件在NCBI蛋白庫中的比對，以確定同源蛋白來源；用SDSPAGE方法測其表觀分子量；用等電聚焦方法測定等電點；用LinwerverBurk雙倒數(shù)作圖法測定米氏常數(shù)；并對該酶的酶學性質(zhì)進行了常規(guī)的測定。[結果]獲得具有膽紅素氧化酶酶活性的電泳純單體蛋白，酶活為46 000 U/L，比活為1.15 U/mg；MALDITOF共獲得135個氨基酸，該蛋白與來源于Helminthosporium triticivulgaris的漆酶前體蛋白序列同源性達100%；蛋白的表觀分子量為68 kDa；pI為4.1；它對ABTS和膽紅素的米氏常數(shù)分別為Km（ABTS）=1.8×10-5mol/L（pH 3.0）和Km（bilirubin）=2.7×10-5mol/L（pH 7.5）；對膽紅素的最適催化活性為36 ℃，酶在-40 ℃下可保持2年，酶活保持在90%以上，在pH 8～9.5下可保持相當高的催化膽紅素活性，能夠耐受高濃度的硝酸鈉和尿素，低濃度的疊氮化鈉對酶活有促進作用而高濃度則抑制，對氯化鈉、溶解氧敏感。[結論]該蛋白具有典型的膽紅素氧化酶特性，又存在明顯的不同。

關鍵詞 膽紅素氧化酶；Bipolaris australiensis；蛋白純化；鑒定；酶學性質(zhì)

中圖分類號 S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03228-04

Abstract [Objective] The research aimed to obtain a high purity protein of BOD from B. bipolaris HD1， and determined its homology and the common properties. [Method] The supernatant of B. bipolaris HD1 broth was performed by ammonium sulfate salting out， DEAEsepharose fast flow anion exchange chromatography and SephadexG75 gel filtration chromatography respectively. The purity of this protein was determined by SDSPAGE. The specific activity was assayed in TrisHCl buffer at 37 ℃（pH 7.4）. The amino acid residues was determined by Matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry（MALDITOF）and the homology was obtained with software Mascot on the databank of NCBI. The molecular weight was determined by SDSPAGE. The pI was determined by means of isoelectric focusing. The kinetic parameters for this enzyme were determined by LinwerverBurk doublereciprocal plots. The common properties of BOD were assayed by conventional methods. [Result] A single band was obtained by SDSPAGE. The enzyme activity was 46 000 U/L. The specific activity was 1.15 U/mg. A 135 amino acid residue was obtained. There was a 100% homologous with a laccase precousors from Helminthosporium triticivulgaris. The molecular weight was 68 kDa. The pI was 4.1. The kinetic parameters for this enzyme were Km（ABTS）=1.8×10-5mol/L at pH 3.0 and Km（bilirubin）=2.7×10-5mol/L at pH 7.5 respectively. The common properties of this enzyme shown as： the enzyme had a optimum temperature to catalyze bilirubin to biliverdin at 36 ℃， it was stable at -40 ℃ or lower and keep activity up to 90% for two years， it could keep a high activity in range of pH from 8 to 9.5， the enzyme had activity in condition that higher concentration of sodium nitrate and urea， however， the enzyme was inhibited by high concentration of sodium azide， there was a contrary results at lower concentration. It was sensitive for sodium chloride and dissolved oxygen（DO）. [Conclusion] BOD from B. australiensis HD1 exhibited a typical characteristic of BODs， and at that time a significantly different existed.

Key words Bilirubin oxidase； Bipolaris australiensis；Protein purification；Identification； Enzymatic characteristic

膽紅素氧化酶（Bilirubin oxidase，BOD，EC 1.3.3.5）是由日本學者[1]最早從絲狀真菌（Myrothecium verrucaria）中分離并純化出來，因其能催化膽紅素氧化而得名。研究表明，它與漆酶一樣同屬多銅氧化酶（Multicopper oxidases，MCOs）家族，但與漆酶存在眾多方面的異同，如能催化氧化膽紅素，在生理條件下具有相對高的酶活性，對氯離子有高耐受性，對脲反應的特異性等，因而成為理想的制作生物傳感器陰極材料[2-7]。為此，該酶成為目前該領域研究者最為熱衷的研究對象之一。筆者從玉米葉片的病斑中分離得到一株具有較高BOD酶活的菌株，被鑒定為Bipolaris australiensis。為了在實踐中能夠充分利用該酶，筆者對源于Bipolaris australiensis BOD進行了純化和酶學性質(zhì)的研究，為該酶在應用中研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 硫酸銨鹽析

鹽析方法參照文獻[8]。將發(fā)酵培養(yǎng)的菌懸液7 800 g離心30 min，去菌體，收集上清。在室溫下緩緩加入硫酸銨粉末至飽和度為80%，將其置于4 ℃下，緩慢攪拌過夜，離心收集沉淀，用15 mmol/L TrisHCl 含1 mmol/L EDTANa2·2H2O，pH 8.1（16 ℃）緩沖液充分懸浮沉淀后，將所得溶液吸入準備好的透析袋MD34內(nèi)流動水透析過夜，用聚乙二醇20 000濃縮蛋白溶液至適當體積，離心棄沉淀，取10 μl上清檢測酶活，并測定溶液中蛋白質(zhì)濃度，并且將這蛋白溶液作為離子交換層析的上樣樣品。

1.2 DEAE Sepharose FF離子交換層析

用50 mmol/L乙醇胺HNO3 pH 9.5（RT，16 ℃）含10 mmol/L NaNO3緩沖液平衡樹脂后，將盛樹脂的燒杯置于超聲波清洗器內(nèi)50 ℃水浴脫氣3 h。用3倍于柱體積（300 ml）的緩沖液平衡樹脂，上樣3 ml，采用0.8 mol/L NaNO3（用相同緩沖液配制）進行梯度洗脫。從分部收集的每個試管中吸取50 μl液體于酶活測定緩沖液中，加入底物后檢測溶液中是否有酶活性，將檢測到有酶活的試管集中，用超濾管進行濃縮和脫鹽處理。對濃縮后的樣品進行酶活檢測，測定溶液中蛋白質(zhì)濃度。

1.3 Sephadex G75凝膠層析

將已平衡并脫氣的Sephadex G75凝膠裝柱后用50 mmol/L乙醇胺-HNO3含0.2 mol/L NaNO3的緩沖液平衡（總體積200 ml）凝膠后準備上樣。上樣量約為3 ml（ 100 ml 凝膠）。當紫外檢測儀顯示有蛋白流出時開始分部收集，控制流速為1滴/3 s，每管收集約1.5 ml，吸取50 μl用于檢測酶活，并且分別標記有酶活的管號，用超濾管分別對每管樣品溶液進行濃縮和脫鹽處理，對濃縮后的樣品進行酶活檢測和蛋白質(zhì)濃度測定。

1.4 粗酶液的NativePAGE活性染色與分析

粗酶液（經(jīng)硫酸銨鹽析后的濃縮樣品）經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠（濃度9%分離膠濃度）電泳后，將2塊mini膠均放入含有膽紅素的酶活測定緩沖液平皿內(nèi)，緩沖液的量以將潤色條完全浸入為宜，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)放置15～20 min，當凝膠由黃色變?yōu)榫G色（或紫色），并以此確定膽紅素氧化酶所在位置，準確切下變色（紫色和綠色）的膠條，將其分開放入Dtube透析管中，100 V電泳12 h后，反相電泳1～2 min，將透析管中液體吸出置于超濾管中濃縮，吸取10 μl做SDSPAGE檢測，另一塊膠繼續(xù)放置在37 ℃下保持1 h。

1.5 純化后樣品SDSPAGE檢測

取過Sephodex G75凝膠分部收集的濃縮樣品10 μl做SDSPAGE檢測[8]，以確定蛋白質(zhì)的純度及其濃度，并且測定蛋白的分子量[9]。

1.6 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI TOF）

取適量經(jīng)SDSPAGE獲得單一條帶的樣品作為上樣樣品，質(zhì)譜試驗在AB 4800 plus MALDI TOF/TOFTM Aalyzer（USA） 上完成；所有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用GPS ExploredTM軟件分析，搜索引擎是Mascot，數(shù)據(jù)庫為NCBI。

1.7 膽紅素氧化酶酶學性質(zhì)

1.7.1 米氏常數(shù)（Km）的測定。

利用LinwerverBurk[10]雙倒數(shù)作圖法測定。底物分別為膽紅素，λmax=440 nm；2，2-連氮雙（3乙基苯并噻唑6磺酸，ABTS）（sigma），λmax=420 nm。膽紅素的測定體系為15 mmol/L TrisHCl，36 ℃ pH 7.5；ABTS測定緩沖體系為0.1 mol/L檸檬酸磷酸氫二鈉，36 ℃ pH 4.0。以加入底物后30 s之內(nèi)不同底物特征吸收波長的吸光度值變化來計算反應速度（V）。

1.7.2 溫度對酶活的影響。

溫度梯度設為：20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃。配制濃度為0.05 mol/L TrisHCl緩沖液（含1 mmol/L EDTA），每份100 ml分裝于小燒杯中，高壓滅菌后，等其溫度降至室溫后，在不同溫度下預熱緩沖液15 min，用HNO3或NaOH調(diào)緩沖液pH至7.6。取3 ml預熱的緩沖液于10 ml小試管中，加酶液 10 μl，并置于相同溫度下放置15 min。加入底物20 μl，反應3 min后在440 nm處檢測酶活性。取滅菌小試管（10 ml）加入3 ml滅菌的酶活，測定緩沖液，在每管加入酶液20 μl后，將其分別置于不同溫度下，定期吸取100 μl，測定酶活，每個處理重復3次。

1.7.3 pH對酶活的影響。在25 ℃水浴條件下，分別配制50 mmol/L的檸檬酸-Na2HPO4（pH 4.0～7.5）、TrisHNO3（pH 8.0～9.0）及乙醇胺-硝酸（pH 9.5～10.0）緩沖液，pH梯度為0.5，在3 ml體系中加入酶液10 μl，在25 ℃下測定酶活。分別吸取pH為4、5、6、7、8、9、10的上述緩沖液3 ml，過濾除菌后將其置于滅菌的10 ml小試管中，加入酶液30 μl，25 ℃條件下放置，定期吸取100 μl測定其酶活，每個處理3次重復。

1.7.4 抑制劑對酶活的影響。

用蒸餾水配制0.1 mol/L迭氮鈉（NaN2），在3 ml酶活測定緩沖體系（不含EDTA）中使其終濃度分別為4、6、8、10 mmol/L，測試條件同上。

用蒸餾水配制0.1 mol/L尿素（脲），在3 ml體系中使其終濃度分別為4、6、8、10、20、100、500 mol/L，測試條件同上。

1.7.5 溶解氧對酶活的影響。

用蒸餾水配制新鮮的15 mmol/L TrisHCl 緩沖液pH 7.4（36 ℃）（含1 mmol/L EDTA）500 ml，平均分裝為2份，一份置于超聲波清洗槽內(nèi)，在水溫60 ℃，功率為80%，超聲處理3 h（標記為無溶解氧處理）；另一份室溫放置作為對照（標記為有溶解氧處理）。分別吸取不同的緩沖液各3 ml加入酶液10 μl，底物20 μl，在440 nm處36 ℃條件下反應3 min，計算相對酶活。每個處理3次重復。

1.7.6 等電點的測定。

用等電聚焦方法測定。純化后蛋白樣品上樣量15 μl；水化液（8 mol/L尿素、濃度2% CHAPS、濃度2% IPG Buffer（pH 4～7）、濃度0.002%溴酚藍）110 μl。

2.2 NativePAGE電泳分析

鹽析后的粗酶液經(jīng)活性聚丙烯酰胺電泳后，將凝膠放入酶活測定緩沖液中，于37 ℃下加入適量膽紅素溶液染色15 min。由圖1可知，凝膠的染色后的顏色變化過程是先由黃色（膽紅素溶液顏色）變?yōu)榫G色，繼而由綠色變?yōu)樽仙?，再由紫色變?yōu)闊o色透明。從凝膠染色—顏色變色變化—脫為無色時顏色變化的時間先后順序、位置能夠判斷出在電泳條件下，BOD主要集中在分離凝膠的起始至凝膠的1/2處范圍內(nèi)。由于高濃度的BOD與其底物膽紅素作用先產(chǎn)生膽綠素，隨即高濃度的膽綠素可繼續(xù)在該酶的催化下產(chǎn)生紫色化合物，相反在低濃度膽紅素氧化酶區(qū)域酶與底物作用的機會要比前者少得多，形成的膽綠素的量相對少，底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的時間要比高濃度區(qū)域延遲，故而2個區(qū)域在與底物接觸相同的時間內(nèi)可看到紫色和綠色同時存在的現(xiàn)象。

2.3 SDSPAGE電泳分析

經(jīng)一系列的蛋白純化過程，得到的純化蛋白經(jīng)SDSPAGE后得到單一條帶如圖2箭頭所示。所得蛋白溶液中蛋白的含量約為20 μg/μl，表觀分子量約為68 kDa。2.5.2 溫度對酶活的影響。

由圖4可知，在低溫條件下BOD酶活隨溫度的升高而升高，溫度高于40 ℃時酶活性開始下降，溫度高于60 ℃時酶活性喪失。酶活穩(wěn)定性的測定結果表明，該酶在50 ℃下1 h喪失酶活性；在40 ℃下12 h，殘余酶活約為10%；在37 ℃下，24 h后殘余酶活性為80%，62 h后殘余酶活性為25%；在4 ℃下，180 d后，殘余酶活性為86%；在-20 ℃或-40 ℃下，368 d后殘余酶活為90%。

2.5.3 pH對酶活的影響。由圖5可知，膽紅素氧化酶的最適pH為7.5，且該酶在pH 8.0～9.5下能夠保持較高的酶活。

2.5.4 抑制劑對酶活的影響。由圖6可知，當疊氮化鈉濃度

達20 mmol/L時酶活喪失80%以上；尿素對BOD的影響微小而繁雜，在低濃度的尿素（4～10 mmol/L）條件下，隨著尿素含量的升高酶活呈上升趨勢；而隨著尿素濃度的升高酶活又呈下降趨勢，但尿素濃度在20～100 mmol/L范圍內(nèi)時，酶活性幾乎保持不變；當尿素濃度高于100 mmol/L時，酶活又呈緩慢上升趨勢直到恢復原始酶活并且不再隨尿素濃度的上升而發(fā)生變化。

3 結論

通過對Bipolaris australiensis HD1菌株的發(fā)酵液上清依次進行硫酸銨沉淀、DEAE Sepharose FF離子交換交換層析和Sephadex G75凝膠過濾層析，對分部收集的具有BOD酶活的組分分別濃縮，樣品經(jīng)SDSPAGE，獲得該BOD的電泳級純化蛋白，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜法和蛋白同源序列比對，該蛋白與來源于Helminthosporium triticivulgaris（燕麥長蠕孢霉）的漆酶前體蛋白序列同源性達100%；該BOD的分子量約為68 kDa；pI約為4.1；酶的動力學結果顯示該酶對常規(guī)漆酶底物和膽紅素的親和力相當 ，其米氏常數(shù)分別為Km（ABTS）=1.8×10-5 mol/L（pH 3.0）和Km（bilirubin）=2.7×10-5mol/L（pH 7.5），是一個具有較高漆酶和膽紅素氧化酶酶活性的新型蛋白；該酶對膽紅素的最適催化活性為36 ℃，酶在低溫（<-40 ℃）下可長期保持其酶活性；在pH為8.0～9.5時可保持相當高的催化膽紅素活性；該BOD能夠耐受高濃度的硝酸鈉和尿素；低濃度的疊氮化鈉對酶活有促進作用而高濃度則抑制；該酶對氯化鈉、溶解氧敏感。

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