武海萍，卜瑩，張心悅，周國華

1南京軍區(qū)聯勤部藥品儀器檢驗所，南京 210002；2南京大學醫(yī)學院附屬金陵醫(yī)院藥理科，南京 210002

維生素B12注射液細菌內毒素檢查方法的建立*

武海萍1，卜瑩1，張心悅1，周國華2**

1南京軍區(qū)聯勤部藥品儀器檢驗所，南京 210002；2南京大學醫(yī)學院附屬金陵醫(yī)院藥理科，南京 210002

目的：建立維生素B12注射液的細菌內毒素檢查方法。方法：按《中國藥典》2010年版二部（附錄ⅪE）的細菌內毒素檢查方法及指導原則進行實驗。結果：維生素B12注射液的最大不干擾濃度為0.25 mg·mL-1。在內毒素限值確定為400 EU·mg-1情況下，用靈敏度為0.25 EU·mL-1的鱟試劑按凝膠限度檢查法對6批次供試品進行細菌內毒素檢查，結果均符合規(guī)定。結論：建議藥典增加維生素B12注射液的細菌內毒素檢查項，規(guī)定每1mg維生素B12中含內毒素的量應小于400EU。

維生素B12注射液；細菌內毒素；凝膠限度檢查法

維生素B12注射液臨床上主要用于治療原發(fā)性或繼發(fā)性內因子缺乏所致的巨幼細胞貧血，還可用于神經炎的輔助治療等?！吨袊幍洹?010年版二部中維生素B12注射液未收載細菌內毒素檢查項[1]，而《美國藥典》（USP35-NF30）中已收載[2]。為了進一步加強對注射液的質量控制，依據《中國藥典》2010年版二部中有關細菌內毒素的檢查方法[1]及相關文獻[3-6]，進行維生素B12注射液干擾試驗，建立了維生素B12注射液的細菌內毒素檢查方法。

1 材料

1.1 儀器

HG202-2型電熱干燥箱；ET-96型細菌內毒素凝膠檢測儀；WH-3型旋渦混合器；Eppendorf微量移液器；無熱原吸頭。

1.2 試劑

細菌內毒素工作標準品（效價160 EU/支，批號150601-201174，中國食品藥品檢定研究院）；鱟試劑（靈敏度0．25 EU·mL-1，批號1206152，湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑（靈敏度0．25 EU·mL-1，批號1206190，湛江博康海洋生物有限公司）；細菌內毒素檢查用水（BET水，批號1110170，湛江安度斯生物有限公司）。

1.3 試藥

維生素B12注射液（規(guī)格1 mL∶0．5 mg，批號1108182、1103251、1108192，天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司）；維生素B12注射液（規(guī)格1 mL∶0．5 mg，批號20101210、21109021、21110071，湖北天藥藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 內毒素限值的確定

根據《中國藥典》2010年版二部（附錄ⅪE）的有關要求[1]，內毒素限值（L）按以下公式計算：L=K/ M。式中K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K=5 EU/（kg·h）；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量。《臨床用藥須知》2010年版中規(guī)定維生素B12注射液的每日最大用量為500 μg[7]。因此代入公式計算，得到L值為600 EU·mg-1。而《美國藥典》中規(guī)定每1 μg維生素B12中含內毒素的量應小于0．4 EU，其限值較公式計算出的數值更加嚴格。為保障安全用藥，故將維生素B12注射液的內毒素限值確定為400 EU·mg-1。

2.2 鱟試劑靈敏度的復核

為了考察鱟試劑靈敏度的標示值（λ）是否準確、人員操作方法是否正確及實驗條件是否符合規(guī)定，按《中國藥典》2010年版二部（附錄ⅪE）中細菌內毒素規(guī)定λc應在0．5 λ～2 λ（包括0．5 λ和2 λ）。本實驗結果顯示，批號1206152的鱟試劑λc值等于0．5 λ，批號1206190的鱟試劑λc值等于λ，均符合藥典規(guī)定，可以其標示靈敏度0．25 EU·mL-1用于細菌內毒素檢查。

2.3 干擾試驗的預實驗

為確定維生素B12注射液在多大濃度下對內毒素和鱟試劑的反應不存在干擾作用，首先進行干擾試驗的預實驗。按照公式最大稀釋倍數Dλ0.03=CL/ λ0.03，計算得到維生素B12注射液Dλ0.03=6666.7，即最大的稀釋倍數不得超過6666.7倍。因此將維生素B12注射液供試品用BET水分別稀釋2、20、200、800、1600、3200、6400倍，將此系列溶液記為供試品陰性對照（NPC）；制備同樣系列濃度的供試液，并使每個稀釋倍數的供試液中均含有2 λ濃度的內毒素標準溶液，記此系列溶液為供試品陽性對照（PPC）。取靈敏度為0.25 EU·mL-1的鱟試劑，分別對上述NPC和PPC溶液進行檢驗，每一個平行做2支；另取2支鱟試劑加入2 λ濃度的內毒素標準溶液作為陽性對照（PC）；2支加入BET水作為陰性對照（NC）。37℃保溫60 min后，觀察記錄結果。

使用兩個廠家鱟試劑的檢驗結果見表1。陰性對照均為陰性，陽性對照均為陽性，表明實驗有效；兩個廠家的鱟試劑檢驗結果相同，2個供試品對鱟試劑的反應結果也相同，表明該品種適于建立內毒素檢查法；在系列濃度中出現供試品陽性對照為陽性且供試品稀釋液為陰性的最小稀釋倍數為2，即維生素B12注射液的最大不干擾濃度為0.25 mg· mL-1。

表1 維生素B12注射液干擾試驗預實驗結果

2.4 正式干擾試驗

根據預實驗結果，在進行正式干擾試驗時選擇供試品的不干擾濃度為0.0625 mg·mL-1。取兩個不同廠家的共6個供試品，用BET水稀釋8倍至終濃度為0.0625 mg·mL-1，分別用0.0625 mg·mL-1的供試品稀釋液和BET水稀釋細菌內毒素標準品，制備成含0.5、0.25、0.125、0.0625EU·mL-14種濃度內毒素的系列溶液。按照《中國藥典》2010年版中的凝膠法進行干擾試驗，測定結果如表2所示。

表2 維生素B12注射液干擾試驗結果

使用湛江安度斯生物有限公司生產的鱟試劑（批號1206152）的檢驗結果顯示，Es等于0.5 λ（0.125 EU·mL-1），且6批供試品的Et值均等于Es。使用湛江博康海洋生物有限公司生產的鱟試劑（批號1206190）的檢驗結果顯示，Es等于λ（0.25 EU· mL-1），且6批供試品的Et值均在0.5～2 Es（0.125～0.5 EU·mL-1）?！吨袊幍洹?010年版中規(guī)定Es在0.5～2 λ（包括0.5 λ和2 λ）及Et在0.5～2 Es（包括0.5 Es和2 Es）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。因此，本干擾試驗的結果表明，用兩個廠家的鱟試劑（靈敏度均為0.25 EU·mL-1）進行檢驗，該6批供試品在8倍稀釋條件下均無干擾作用。

2.5 供試品細菌內毒素檢查

用靈敏度為0.25 EU·mL-1的鱟試劑，按《中國藥典》2010年版二部（附錄ⅪE）中的凝膠限度試驗檢查法，對6批次供試品進行細菌內毒素檢查。計算最大有效稀釋倍數MVD=800。將供試品稀釋800倍制備成供試品溶液（NPC），制備供試品溶液中含2 λ濃度的內毒素標準品（PPC），同時設立陽性對照即2 λ濃度的內毒素標準品，陰性對照即BET水。檢驗結果顯示6批次供試品的檢驗結果均符合內毒素限值為400 EU·mg-1的規(guī)定。

3 討論

供試品對不同廠家的鱟試劑的干擾程度可能存在不同，因此在干擾試驗的預實驗中使用了兩個不同廠家的鱟試劑，分別對兩個生產廠家各2個批次的維生素B12注射液進行凝膠法內毒素檢查，結果顯示兩個廠家的鱟試劑檢驗結果相同，不同生產廠家以及同一廠家不同批次的供試品對鱟試劑的反應結果也無差異，因此確定維生素B12注射液的最大不干擾濃度為0.25 mg·mL-1。在正式干擾實驗中，將供試品稀釋至0.0625 mg·mL-1，用兩個廠家的鱟試劑進行干擾驗證，結果顯示Es均在0.5～2 λ范圍，6個供試品的Et均在0.5～2Es范圍，確認在該濃度下供試品無干擾作用。

在內毒素限值確定為400 EU·mg-1情況下，用靈敏度為0.25 EU·mL-1的鱟試劑按凝膠限度檢查法對6批次供試品進行細菌內毒素檢查，結果均符合規(guī)定，表明維生素B12注射液可適用凝膠法進行細菌內毒素檢查。因此，建議《中國藥典》增加維生素B12注射液的細菌內毒素檢查項，規(guī)定每1 mg維生素B12中含內毒素的量應小于400 EU。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：901，附錄99-101.

[2] The United States Pharmacopeial Convention.United States Pharmacopoeia(USP35-NF30)[S].United Book Press,Inc.,Baltimore,MD,2012:2784.

[3] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：310-25.

[4] 樊華，林鵬，焉媛媛，等.9個生產企業(yè)清開靈注射液細菌內毒素檢查方法學研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2014，16（4）：48-50.

[5] 時榮同，謝冬梅，郭道華，等.地佐辛注射液細菌內毒素檢查法研究[J].中國實用醫(yī)藥，2013，8（31）：3-4.

[6] 代秀梅，于風平.氟馬西尼注射液細菌內毒素檢查方法的建立[J].中國藥房，2014，25（21）：2003-4.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典臨床用藥須知：化學藥和生物制品卷[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1052-4.

Development of Bacterial Endotoxin Test Method for Vitamin B12Injection

WU Hai-ping1,BU Ying1,ZHANG Xin-yue1,ZHOU Guo-hua2*
1The Institute of Quality Control of Medical Material and Equipment under the Joint Logistic Department of Nanjing Command,Nanjing 210002;2Department of Pharmacology,Jinling Hospital,Medical School of Nanjing University,Nanjing,210002,China

Objective：To establish a detection method of the bacterial endotoxin in Vitamin B12injection.Methods：The experiments were done according to the bacterial endotoxin detection method and guiding principles in Chinese Pharmacopoeia 2010 edition(appendixⅪE).Results：The maximum undisturbed concentration of vitamin B12injection was 0.25 mg·mL-1in the bacterial endotoxin test.Six batches of samples were detected by using limulus reagents wit sensitivity at 0.25 EU·mL-1,and the results were all qualified to the standards under the threshold of bacterial endotoxin within 400 EU·mg-1.Conclusion：The bacterial endotoxin inspection items should be supplied in Chinese Pharmacopoeia,and the amount of bacterial endotoxin in Vitamin B12should be under 400 EU per mg.

Vitamin B12injection;Bacterial endotoxin;Gel limit test

R927.12

A

1673-7806（2014）06-521-03

第54批中國博士后科學基金面上資助項目（2013M542575）；國家自然科學基金項目（31300706）

武海萍，女，博士，主管藥師，研究方向：藥物分析 E-mail:fenger19800512@126.com

**通訊作者 周國華，男，主任藥師 E-mail:ghzhou@nju.edu.cn

2014-06-29

2014-07-18