黃莉莉，王欣，李磊，陳軍，蔡寶昌

1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，南京　210008；2南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京　210023

馬錢子堿貼膏劑的抗腫瘤作用研究*

黃莉莉1，王欣1，李磊2，陳軍2，蔡寶昌2

1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，南京210008；2南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京210023

摘要目的：評價馬錢子堿貼膏劑的抗腫瘤作用。方法：采用H22荷瘤小鼠模型，按高（240mg· kg-1）、中（120mg·kg-1）、低（60mg·kg-1）三個劑量給予馬錢子堿貼膏劑，測定抗腫瘤作用及毒性。結(jié)果：與空白對照組相比，馬錢子堿貼膏劑中劑量（120mg·kg-1）和高劑量（240mg·kg-1）對H22荷瘤小鼠腫瘤生長抑制差異有顯著性，中濃度的抑制率達到46.5%。馬錢子堿貼膏劑未觀察到具有免疫抑制作用和體重減輕作用，也未觀測到血液毒性。結(jié)論：馬錢子堿貼膏劑具有抗腫瘤藥效，并且應(yīng)用安全。

關(guān)鍵詞馬錢子堿；貼膏劑；經(jīng)皮給藥；抗腫瘤

現(xiàn)代研究表明，馬錢子堿（brucine）是毒性中藥馬錢子成分中藥理活性較高且毒性較低的生物堿成分，在抗腫瘤、鎮(zhèn)痛方面作用顯著[1-2]。將馬錢子堿研制成治療癌性疼痛的新型外用制劑——馬錢子堿貼膏劑[3-4]，有利于改善透皮吸收，發(fā)揮藥效。

本實驗研究前期已通過小鼠熱板法和醋酸扭體法等鎮(zhèn)痛實驗?zāi)Ｐ痛_定了馬錢子堿貼劑的有效鎮(zhèn)痛劑量為60 mg·kg-1，因此在鎮(zhèn)痛劑量下考察馬錢子堿貼劑的動物體內(nèi)抗腫瘤作用具有重要意義。藥物體內(nèi)抗腫瘤作用研究多采用移植性腫瘤模型，也是篩選抗腫瘤新藥中最常用的模型。目前所應(yīng)用的大多數(shù)抗腫瘤藥物都是通過此類模型實驗而被廣泛采用。移植性腫瘤模型，接種存活率高、個體差異小、生長速度快、試驗時間短、易于客觀判斷療效，多采用小鼠移植瘤。

肝癌H22瘤株生長迅速，癌細胞增殖比例高，倍增時間短，對抗癌藥物較敏感，為常用的移植性腫瘤模型的癌細胞瘤株。因此本實驗選擇該模型，考察馬錢子堿貼膏劑在不同劑量下對H22荷瘤小鼠模型的抗腫瘤作用，以確定有效劑量，同時考察其對免疫系統(tǒng)及造血系統(tǒng)的毒性。

1　儀器與材料

1.1儀器

BS124S電子天平（德國賽多利斯公司）；層流潔凈工作臺（YJ2875，蘇州凈化設(shè)備總廠）；XS-800i型血細胞分析儀（日本SYSMEX公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（model680，Bio-Rad公司）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移（AST）定量檢測試劑盒（ELISA）、尿素氮（BUN）定量檢測試劑盒（ELISA）（均美國R&D公司）。

1.2試藥

馬錢子堿貼膏劑（自制，具體制備與含量測定方法參見文獻[4]，馬錢子堿含量為3.15 mg·cm-2）；順鉑（Cisplatin，CDDP）注射粉針劑（20 mg/支），齊魯制藥廠，批號：0310035；等滲氯化鈉注射液（南京小營制藥廠生產(chǎn)，批號：04062204）。

1.3實驗動物與瘤株

ICR小鼠，6～8周，雄性，體重18～22 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2007-0001；肝癌細胞株H22為南京市鼓樓醫(yī)院提供，由本實驗室定期腹腔接種傳代；小鼠肉瘤S180細胞株為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供提供，由本實驗室定期腹腔接種傳代。

2　實驗方法

2.1腫瘤接種

小鼠常規(guī)飼養(yǎng)。另取傳代保種7 d，腫瘤生長旺盛，且無潰破的健康腹腔接種H22腫瘤細胞的小鼠，頸椎脫臼處死，在超凈工作臺上從腹腔抽出乳白色濃稠腹水瘤液，用等滲氯化鈉注射液按1∶3～1∶5比例制成腫瘤細胞懸液，計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞數(shù)為2×107/L，每只小鼠接種0.2 mL（前肢腋窩皮下）。

2.2分組及給藥

小鼠接種后隨機分組，馬錢子堿貼劑組設(shè)3個劑量組：高（240 mg·kg-1）、中（120 mg·kg-1）、低（60 mg·kg-1），及空白基質(zhì)組（按高劑量貼劑給藥面積計即2 cm2）、陽性藥順鉑組（3 mg·kg-1，ip）；每組10只小鼠。其中貼劑給藥組及空白基質(zhì)組于腹部機械脫毛，盡量不損傷腹部皮膚。接種24 h后貼劑組及空白基質(zhì)組腹部給予相應(yīng)面積貼劑，并以醫(yī)用膠帶外裹固定防止小鼠撕咬。陽性藥順鉑組腹腔注射給藥。各給藥組均為每日給藥1次，每天觀察記錄小鼠生活狀況并稱體重，連續(xù)給藥10天。

2.3指標測定

H22荷瘤小鼠于末次給藥后禁食不禁水12 h以上，第11天經(jīng)眼眶取血后處死，小心剝離瘤塊、胸腺和脾臟，分別稱重記錄。計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，并匯總每組小鼠10天給藥期間平均體重變化；抽取的血液經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝用于血細胞分析儀測定血常規(guī)指數(shù)：白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）。根據(jù)下面公式計算抑瘤率（Tumor inhibitory rate，TIR）等。

3　實驗結(jié)果

3.1對H22荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用

實驗結(jié)果見圖1。由結(jié)果可知，馬錢子堿貼膏劑對H22荷瘤小鼠表現(xiàn)出明顯的抑瘤作用，瘤重明顯減輕。與空白對照組相比，馬錢子堿貼膏劑中劑量（120 mg·kg-1）和高劑量（240 mg·kg-1）組對H22荷瘤小鼠腫瘤生長抑制差異有顯著性；低劑量組（60 mg· kg-1）有一定的抑瘤效果，但是與空白基質(zhì)組相比差別不明顯。其中馬錢子堿貼膏劑在60、120、240 mg· kg-1劑量時的抑瘤率分別為18.09%、46.5%和43.92%。陽性藥順鉑的抑瘤率為89.29%。

3.2對H22荷瘤小鼠體重的影響

各組小鼠11天內(nèi)平均體重變化曲線圖（生長曲線圖）見圖2。結(jié)果表明與空白基質(zhì)組相比，陽性藥順鉑組在給藥10天內(nèi)體重明顯下降；而馬錢子堿貼膏劑組平均體重與空白基質(zhì)組一樣呈緩慢增長趨勢，對小鼠無體重抑制作用。

3.3對H22荷瘤小鼠免疫器官重量及指數(shù)的影響

從圖3、圖4可以看出，與空白基質(zhì)組相比，陽性藥順鉑組小鼠的胸腺、脾臟重量及其指數(shù)均明顯低于空白基質(zhì)組，表明順鉑對小鼠的免疫器官具有明顯的抑制作用；而馬錢子堿貼膏劑中劑量（120mg· kg-1）和高劑量（240 mg·kg-1）組，對H22荷瘤小鼠的胸腺及脾臟指數(shù)均有一定的增加作用。而低劑量（30 mg·kg-1）組作用不明顯。這提示馬錢子堿對小鼠免疫器官無明顯的抑制作用。

圖1　不同劑量馬錢子堿貼膏劑經(jīng)皮給藥后H22荷瘤小鼠的瘤重

圖2　不同劑量馬錢子堿貼膏劑經(jīng)皮給藥后對H22荷瘤小鼠體重的影響

圖3　馬錢子堿貼膏劑對H22荷瘤小鼠胸腺指數(shù)的影響

圖4　馬錢子堿貼膏劑對H22荷瘤小鼠脾臟指數(shù)的影響

3.4對H22荷瘤小鼠血常規(guī)指數(shù)的影響

從表1可以看出，5 mg·kg-1的順鉑注射液可明顯降低H22荷瘤小鼠的白細胞數(shù)和血小板數(shù)，說明順鉑對小鼠免疫和造血系統(tǒng)有著明顯抑制作用；而馬錢子堿貼膏劑高、中、低劑量組對H22小鼠的白細胞及血小板均無明顯影響。說明短期內(nèi)60～240 mg· kg-1的馬錢子堿貼膏劑對其造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)沒有明顯影響。

表1　馬錢子堿貼膏劑對H22荷瘤小鼠血常規(guī)指數(shù)的影響（±s，n=10）

表1　馬錢子堿貼膏劑對H22荷瘤小鼠血常規(guī)指數(shù)的影響（±s，n=10）

注：統(tǒng)計學(xué)比較采用t檢驗，以空白基質(zhì)組為對照，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

組別劑量（mg·kg-1）白細胞（WBC）×109/L紅細胞（RBC）×1012/L血紅蛋白（HGB）×g·L-1血小板（PLT）×109/L空白基質(zhì)組25.28±9.626.96±0.81104.67±13.001722.33±260.41陽性藥組58.32±2.76**10.49±0.69**168.33±10.61**326.5±95.60**低劑量組6018.5±6.776.94±0.5386.00±38.161993.17±248.10中劑量組12025.05±9.687.81±0.75115.33±10.171896.83±52.27高劑量組24022.48±5.517.26±0.9787.58±37.141814.5±216.24

4　討論

有研究表明，馬錢子堿及其脂質(zhì)體注射液[5]在移植性小鼠腫瘤模型中對腫瘤生長有著顯著的抑制作用。本文首次采用馬錢子堿貼膏劑這一外用經(jīng)皮給藥制劑觀察了馬錢子堿對肝癌H22的腫瘤抑制作用，考察其抗腫瘤的有效劑量，以期采用貼膏劑這種緩釋制劑達到降低馬錢子堿的毒性并提高其抗腫瘤的作用。從結(jié)果可以看出，馬錢子堿對H22荷瘤小鼠表現(xiàn)出明顯的抑瘤作用，在120 mg·kg-1時抑瘤作用最佳。

實驗還系統(tǒng)考察了馬錢子堿貼膏劑對H22荷瘤小鼠免疫器官、造血系統(tǒng)的毒性以及對體重的影響（免疫器官重量、體重、白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)的下降均可認為是藥物的毒性）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬錢子堿貼膏劑在各給藥劑量下對荷瘤模型小鼠的免疫器官和造血系統(tǒng)均未產(chǎn)生明顯的抑制作用或進一步的損傷。

本文研究表明，馬錢子堿貼膏劑對移植性腫瘤模型具有明顯的抑瘤作用，而且沒有西藥抗腫瘤藥所具有的副作用，如明顯的減輕體重、抑制和損害造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等，這些特點使馬錢子堿貼膏劑成為一種具有開發(fā)前景的抗腫瘤新藥劑型。體外研究表明，馬錢子堿對人肝癌細胞療效確切[2]，因此未來的研究還應(yīng)采用裸鼠移植人肝癌模型評價馬錢子堿貼膏劑的抗腫瘤效果。

參考文獻

[1] Yin W,Wang TS,Yin FZ,et al.Analgesic and antiinflmmatory properties of brucine and brucine N-oxide extracted fromseeds of Strychnosnux-vomica[J].J Ethnopharmacol,2003,88:205-14.

[2] Deng XK,Yin W,Li WD,et al.The anti-tumor effects of alkaloids fromthe seeds of strychnosnux-vomica on HepG2 cells and its possible mechanism[J].JEthnopharmacol,2006,106:179-86.

[3] 陳軍，李磊，祁艷，等.羥丙基-β-環(huán)糊精對馬錢子堿貼膏劑藥劑學(xué)性質(zhì)的影響[J].中草藥，2012，43（11）：2168-72.

[4] 陳軍，李磊，祁艷，等.馬錢子堿貼膏劑的制備與藥物動力學(xué)研究[J].中藥材，2012，35（8）：1295-8.

[5] 瞿葉清，郭玉琴，哈惠馨，等.馬錢子堿隱形脂質(zhì)體與普通脂質(zhì)體的抗腫瘤作用比較[J].中藥新藥與臨床藥理，2008，19（5）：361-3.

中圖分類號R965.1

文獻標志碼A

文章編號1673-7806（2014）05-398-03

*基金項目科技部十一五重大新藥創(chuàng)制項目（2009ZX09103-342）

作者簡介黃莉莉，主管藥師Tel:025-83304616E-mail:gracehuang_1999@sina.com

收稿日期2014-04-15修回日期2014-06-10

Evaluation of Antitumor Efficacy of Hydrogel Patches Containing Brucine*

HUANG Li-li1,WANG Xin1,LI Lei2,CHEN Jun2,CAI Bao-chang2
1The Affiliated DrumTower Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008;2School of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine Nanjing 210023

ABSTRACTObjective：To evaluate the antitumor efficacy of hydrogel patches containing brucine.Methods：Brucine hydrogel patches were administered by dermal route to H22tumor-bearing mice at the dose of 240,120 and 60 mg·kg-1,respectively.Tumor inhibition ratio and toxicity were observed.Results：Significant inhibition ratios were obtained following administration of 120 and 240 mg·kg-1.The tumor inhibition ratio of 120 mg·kg-1dose group was determined to be 46.5%.No immune inhibition effect and body weight reducing effect were observed,neither was hematological toxicity.Conclusions：Brucine hydrogel patches might be safe and effective for the application of antitumor therapy.

KEY WORDSBrucine;Hydrogel patches;Dermal administration;Antitumor