CML28與WT1在急性白血病細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)性

白雪玲，莊紅麗

急性白血病(acute leukemia，AL)是常見(jiàn)的造血干/祖細(xì)胞惡性克隆性疾病之一。其發(fā)病機(jī)制包括以激活信號(hào)傳遞為主的基因突變(FLT3、c-KIT、RAS等)，可導(dǎo)致白血病細(xì)胞異常增殖，以及影響轉(zhuǎn)錄因子或輔助活化復(fù)合物(C/EBPA、MLL、NPM1等)所致的細(xì)胞分化受損等［1］。因此，基因突變或基因表達(dá)調(diào)節(jié)紊亂在AL的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)非常重要的地位。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原分子CML28或WT1高表達(dá)于急性白血病細(xì)胞中，尤其是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)細(xì)胞中［2］。

近年來(lái)，關(guān)于CML28分子在白血病表達(dá)、微小殘留病(minimal residual disease，MRD)檢測(cè)及白血病復(fù)發(fā)等方面的研究顯示，CML28分子在白血病發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用。此外筆者已經(jīng)做過(guò)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CML28分子在白血病中的作用，諸如:樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)，DC免疫應(yīng)答疫苗的構(gòu)建，樹突狀細(xì)胞負(fù)載CML28抗原誘導(dǎo)特異性的CTLs，RNA干擾SOCS1基因表達(dá)對(duì)DC成熟和功能的影響，以及DC疫苗的增敏作用研究等［3-5］。在靶向治療日益重要的今天，CML28分子有望成為一個(gè)很好的基因治療靶點(diǎn)，而WT1分子與其有著相似的表達(dá)譜，是公認(rèn)的檢測(cè)MRD的標(biāo)記分子［6，7］，為此筆者擬通過(guò)如下實(shí)驗(yàn)探討CML28分子與WT1分子在白血病細(xì)胞中的表達(dá)情況及可能的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 收集華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院2009-01至2009-06收住入院的29例初治AL患者骨髓標(biāo)本。

1.2 試劑及設(shè)備 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于加拿大的Fermentas公司;Realtime PCR Master Mix(SYBR GREEN)購(gòu)于日本的TOYOBO公司;Doc Gel 2000凝膠圖像分析系統(tǒng)購(gòu)于英國(guó)的Pharmacia Biotech公司;低溫高速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)的Heraus公司;STEPONE-7500 48孔實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司(精密度99.7%);PCR反應(yīng)儀購(gòu)于美國(guó)的ABI公司;Trizol試劑購(gòu)于陜西Invitrogen公司;Ficoll分離液購(gòu)于上海GE公司;1×紅細(xì)胞裂解液(自配:2M Tris-HCl pH8.2，0.5 ml;4M NaCl 10ml，2 mM EDTA 0.4 ml，加ddH2O至100 ml，高壓滅菌，4℃保存);實(shí)驗(yàn)中所使用引物由上海生工設(shè)計(jì)并合成。

1.3 方法

1.3.1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞的提取 收集29例臨床初治急性白血病患者骨髓標(biāo)本，F(xiàn)icoll分離液及1×紅細(xì)胞裂解液獲取骨髓標(biāo)本中的單個(gè)核細(xì)胞，按Ficoll分離液說(shuō)明書操作，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取106～107單個(gè)核細(xì)胞加入1 ml Trizol試劑，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，試劑準(zhǔn)備:氯仿、異丙醇、75%乙醇、Free RNase水，按Trizol試劑說(shuō)明書操作。采用Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)及凝膠電泳分析

1.3.3.1 特異性反轉(zhuǎn)錄PCR引物序列 見(jiàn)表1。

表1 特異性人反轉(zhuǎn)錄PCR引物序列

1.3.3.2 反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng) 以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系及條件如下:10× Reaction buffer 2.5 μl，DNTPmix(2 mmol/L)2.5μl，Mg2+1.75 μl，cDNA1.0 μl，Taq 酶0.75 μl，上、下游引物(5 pmol/L)各1.0 μl，ddH2O 12.5 μl，總反應(yīng)體積25.0 μl。三種基因反應(yīng)條件相同:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，終末延伸10 min。

1.3.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 制備1%瓊脂糖凝膠，上樣電泳后，0.5%EB溶液染色30 min，Doc Gel2000凝膠圖像分析系統(tǒng)分析染色后的瓊脂糖凝膠。

1.3.4 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)采集

1.3.4.1 特異性實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)引物序列 見(jiàn)表2。

表2 特異性人實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.3.4.2 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系及條件按SYBY GREEN Master Mix說(shuō)明書進(jìn)行，如下2×SYBY GREEN Master Mix 5 μl，上、下游引物(5 pmol/L)各1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 2 μl，總反應(yīng)體積10 μl。三種基因反應(yīng)條件相同:95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s(collect data)，共40個(gè)反應(yīng)循環(huán)。

1.3.4.3 數(shù)據(jù)采集 選CML28及 WT1高表達(dá)的K562細(xì)胞為參照，骨髓標(biāo)本及K562細(xì)胞的內(nèi)參基因GAPDH的CT值控制在19～21，每樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔，重復(fù)2次取平均值。2-ΔΔCT表示試驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)，由此得到目的基因CML28、WT1相對(duì)于管家基因GAPDH的拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分類資料采用SPEARMAN分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)檢測(cè)CML28與WT1在AL患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)情況 圖像分析結(jié)果顯示，在預(yù)定的699 bp處可看到CML28清晰明亮的條帶，預(yù)定的598 bp處可看到清晰的GAPDH內(nèi)參條帶，預(yù)定的198 bp處可看到清晰的WT1的條帶(圖1、2)。

圖1 AL患者骨髓細(xì)胞中CML28的表達(dá)

圖2 AL患者骨髓細(xì)胞中WT1的表達(dá)

2.2 Real time PCR檢測(cè)CML28及WT1在AL患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)情況 由圖3可以明顯看出29例臨床骨髓標(biāo)本中的CML28和WT1分子的mRNA表達(dá)水平的變化趨勢(shì)及方向基本上是一致的，擬合度相似。

圖3 CML28與WT1分子在急性白血病骨髓細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.3 相關(guān)性分析結(jié)果 SPSS17.0軟件分析兩組數(shù)據(jù)均為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，采用SPEARMAN分析兩組數(shù)據(jù)間的相關(guān)性，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，r=0.462，P=0.008，二者有明顯的正相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

CML28分子是由Yang等［3］利用血清篩選重組cDNA表達(dá)文庫(kù)(SEREX)技術(shù)，從異基因造血干細(xì)胞移植(HSCT)后復(fù)發(fā)并經(jīng)供者淋巴細(xì)胞輸注重新達(dá)到緩解的慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)患者的血清中篩選出的一個(gè)靶抗原，基因全長(zhǎng)為1126 bp，定位于19號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)3帶(19q13);CML28分子具有較強(qiáng)的免疫原性，高表達(dá)于各種增殖能力旺盛的實(shí)體腫瘤、急性白血病、慢性髓系白血病的急變期以及CD34+的造血前體祖細(xì)胞中等［3，8］。

目前，關(guān)于白血病發(fā)病機(jī)制的研究越來(lái)越多，其中轉(zhuǎn)錄后調(diào)控紊亂是導(dǎo)致白血病發(fā)生的重要機(jī)制之一。眾所周知，mRNA水平的基因調(diào)節(jié)極其復(fù)雜，尤其是關(guān)于前mRNA的剪接、編輯、輸出、mRNA的定位、翻譯及穩(wěn)定的研究，以驚人的速率增長(zhǎng)著，越來(lái)越多的涉及基因表達(dá)和調(diào)節(jié)的蛋白被發(fā)現(xiàn)是多功能的，大部分多功能的蛋白質(zhì)都含有可以結(jié)合DNA、RNA以及調(diào)節(jié)蛋白的C2-H2鋅指結(jié)構(gòu)環(huán)，而WT1就是鋅指蛋白的典型代表［9-11］。此外，文獻(xiàn)［12-15］也通過(guò)一系列的試驗(yàn)證實(shí)鋅指病毒蛋白(Zinc-finger antiviral protein，ZAP)可以通過(guò)其特有的C2-H2鋅指結(jié)構(gòu)環(huán)募集人的EXOSOME的核心成分之一hR-rP46P來(lái)發(fā)揮其相應(yīng)的生物活性，而研究發(fā)現(xiàn)CML28分子與人EXOSOM的核心成分之一hR-rP46P，除了在5'端編碼區(qū)多出了33個(gè)氨基酸的編碼序列外，二者的核苷酸序列完全相同［3］，說(shuō)明CML28分子是hRrP46P的類似物，那么筆者推測(cè)WT1也可以通過(guò)其特有的C2-H2鋅指結(jié)構(gòu)環(huán)和hR-rP46P類似物CML28分子協(xié)同發(fā)揮作用。

WT1在急性白血病中的高表達(dá)是首先被Miwa等報(bào)道的，研究顯示W(wǎng)T1在ALL、CML、MDS、兒童AML以及正常人CD34+造血前體細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)［4，7，12-13］。這與CML28分子在白血病中的表達(dá)譜是相似的，也和筆者早期及本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是比較吻合的，在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)RT-PCR及實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)出CML28與WT1在AL患者骨髓中同時(shí)高表達(dá)，尤其是在急性髓系白血病中表達(dá)更高，且二者mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明二者在AL的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后評(píng)估中都扮演著很重要的角色。目前，關(guān)于CML28與WT1是否可以作為評(píng)價(jià)急性白血病療效、判斷預(yù)后及預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的標(biāo)記分子均值得期待。

［1］Renneville A，Roumier C，Biggio V，et al.Cooperating gene mutations in acute myeloid leukemia:a review ofthe literature［J］.Leukemia，2008，22(5):915-931.

［2］Scholl C，Gilliland D G，F(xiàn)r?hling S.Deregulation of signaling pathways in acute myeloid leukemia［J］.Semin Oncol，2008，35(4):336-345.

［3］Yang X F，Wu C J，Chen L，et al.CML28 is a broadly immunogenic antigen，which is overexpressed in tumor cells［J］.Cncer Res，2002，62(19):5517-5522.

［4］Zhou H，Zhang D，Wang Y，et al.Induction of CML28-specific cytotoxic T cell responses using co-transfected dendritic cells with CML28 DNA vaccine and SOCS1 small interfering RNA expression vector［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，347(1):200-207.

［5］Zhang D H，Zhou H S，Y Y，et al.Construction and expression of dendritic cell nucleic acid vaccine containing CML28 gene in human dendritic cells［J］.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2005，13(4):631-636.

［6］張東華，戴 敏，周紅升，等.實(shí)時(shí)定量RT-PCR監(jiān)測(cè)造血干細(xì)胞移植前后CML28 mRNA表達(dá)［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2005，13(5):843-847.

［7］Inoue K，Sugiyama H，Ogawa H，et al.WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia［J］.Blood，1994，84(9):3071-3079.

［8］Catherine J W，Melinda B，Jeffery L，et al.Graft-versus-Leukemia Target Antigens in Chronic Myelogenous Leukemia Are Expressed on Myeloid Progenitor Cells［J］.Clin Cancer Res，2005，11(12):4504-4511.

［9］Liu Q，Greimann J C.Reconstitution，Activities，and Structure of the Eukaryotic RNA Exosome［J］.Cell，2006，127(6)，1223-1237.

［10］Fasken M B，Corbett A H.Mechanisms of nuclear mRNA quality control［J］.RNA Biol，2009，6(3):237-241.

［11］Ladomery M，Dellaire G.Multifunctional zinc finger proteins in development and disease［J］.Ann Um Genet，2002，66(Pt 5-6):331-342.

［12］Davies J A，Ladomery M，Hohenstein P，et al.Development of an siRNA-based method for repressing specific genes in renal organ culture and its use to show that the Wt1 tumour suppressor is required for nephron differentiation［J］.Hum Mol Genet，2004，13(2):235-246.

［13］Ariyaratana S，Loeb D M.The role of the Wilms tumour gene(WT1)in normal and malignant haematopoiesis［J］.Expert Rev Mol Med，2007，9(14):1-17.

［14］Bergmann L，Miething C，Maurer U，et al.High levels of Wilms’tumor gene(wt1)mRNA in acute myeloid leukemias are associated with a worse long-term outcome［J］.Blood，1997，90(3):1217-1225.

［15］Guo X，Ma J，Sun J，et al.The zinc-finger antiviral protein recruits the RNA processing exosome to degrade the target mRNA［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(1):151-156.