胡翠敏，王 倩，龔志偉，楊曉兵，靳國杰，沈宏偉，趙宗保

(1.中國科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所 生物技術(shù)部，大連 116023;2.天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300072)

近年來，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)微生物油脂受到廣泛關(guān)注［1－3］，微生物油脂技術(shù)對緩解生物柴油規(guī)?；a(chǎn)原料短缺的瓶頸具有重要意義。由于木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中同時含有葡萄糖和木糖，高效轉(zhuǎn)化利用葡萄糖和木糖對生物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化過程的經(jīng)濟(jì)性具有重要影響。然而，葡萄糖通常為微生物偏好底物，對木糖利用存在抑制作用。如何克服葡萄糖效應(yīng)，實現(xiàn)五、六碳糖高效共利用，成為當(dāng)前生物煉制研究的熱點(diǎn)之一［4－6］。

跨膜運(yùn)輸是糖分子生物轉(zhuǎn)化的第一步，在某些情況下是限速步驟［7］。酵母菌最常見的2種糖跨膜運(yùn)輸機(jī)制為協(xié)助擴(kuò)散和質(zhì)子/糖同向運(yùn)輸［8－10］。在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中，已發(fā)現(xiàn)20種不同己糖轉(zhuǎn)運(yùn)子均采用協(xié)助擴(kuò)散機(jī)制［11］。雖然質(zhì)子/糖同向運(yùn)輸體系在S.cerevisiae中尚未發(fā)現(xiàn)，但多數(shù)葡萄糖苷類物質(zhì)依賴質(zhì)子同向運(yùn)輸體系［12－13］。釀酒酵母沒有木糖特異的轉(zhuǎn)運(yùn)子，因此木糖跨膜運(yùn)輸借助己糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)實現(xiàn)，但轉(zhuǎn)運(yùn)速率遠(yuǎn)低于葡萄糖［6］。在 S.cerevisiae中表達(dá)來源于 Arabidopsis thaliana的2個轉(zhuǎn)運(yùn)子，提高了木糖轉(zhuǎn)化率，但重組菌株仍然存在葡萄糖效應(yīng)［6］。葡萄糖抑制木糖轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致葡萄糖優(yōu)先利用，推測木糖跨膜運(yùn)輸是木糖利用的限速步驟之一［14－15］。

Hu等［16］研究發(fā)現(xiàn)皮狀絲孢酵母 Trichosporon cutaneum能同步利用葡萄糖和木糖生產(chǎn)油脂，進(jìn)一步研究該酵母利用葡萄糖和木糖的混合糖時沒有底物偏好性，對探索消除葡萄糖效應(yīng)的方法以及纖維素生物能源的生產(chǎn)有重要價值。2-脫氧葡萄糖(2-DOG)由于不易被代謝，且通常與葡萄糖共用轉(zhuǎn)運(yùn)載體，常作為葡萄糖類似物以考察葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律［17－18］。筆者以2-DOG 為底物，考察皮狀絲孢酵母單糖跨膜運(yùn)輸特性，以期揭示葡萄糖和木糖同步利用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 化學(xué)試劑

2-脫氧葡萄糖，Acros公司;N，N'-二環(huán)己基碳化二亞胺 (DCC)、羰基氰化物間氯苯腙 (CCCP)，Sigma公司;4-硝基苯酚 (4-NP)、疊氮化鈉，國藥集團(tuán)。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備

將－80℃保存的皮狀絲孢酵母AS 2.571(中國普通微生物菌種保藏管理中心)在新鮮YEPD(yeast extract、peptone、dextrose)斜面 (葡萄糖 20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂15 g/L)上活化，取一環(huán)接種于裝有50 mL液體YEPD的250 mL三角瓶中，于30℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，然后取0.5 mL二次轉(zhuǎn)接于同樣的培養(yǎng)基，于30℃、200 r/min搖床中培養(yǎng) 18 h。8 000 r/min離心5 min，用0.1 mol/L KH2PO4溶液 (pH 4.6)洗滌2遍［19］，并重懸于該溶液至細(xì)胞質(zhì)量濃度為10 g/L(以細(xì)胞干質(zhì)量計)，于30℃、200 r/min培養(yǎng)30 min后置于0℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 轉(zhuǎn)運(yùn)實驗操作及試樣制備

取0℃保存的菌懸液1 mL與底物一起于30℃平衡10 min，加入200 μL底物與菌懸液混合開始反應(yīng)，混勻，取1 mL菌液用0.45 μm真空膜快速(耗時60 s)過濾，用3.0 mL冰水洗滌菌體，將菌體連同濾膜轉(zhuǎn)移到1 mL水中，微波處理并迅速冷卻(800 W，1 min/次，2次)，再加入1 mL水混勻，離心取上清液備用。為了排除細(xì)胞對底物的非特異性吸附，采用菌體和底物均在0℃平衡，混合后迅速過濾，按照上述方法測定細(xì)胞吸附底物的量。

①葡萄糖和木糖對2-DOG跨膜運(yùn)輸?shù)挠绊?。將葡萄糖或木糖與2-DOG混合，同時作為底物考察其對2-DOG跨膜運(yùn)輸?shù)挠绊憽?/p>

②轉(zhuǎn)運(yùn)抑制作用考察。反應(yīng)開始前2 min向菌液添加不同濃度的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(疊氮化鈉，DCC，CCCP或4-NP)，取疊氮化鈉水溶液或其他3種化合物95%乙醇溶液(乙醇在反應(yīng)混合物中的體積分?jǐn)?shù)低于1%)10 μL，然后添加 190 μL 濃度為 0.475 mmol/L的2-DOG開始反應(yīng)，對照組分別添加10 μL水和10 μL 95%乙醇，考察它們對2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

③pH對2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。用 KH2PO4和K2HPO4配制不同pH的緩沖液，濃度為0.1 mol/L。細(xì)胞懸液用緩沖液洗滌1遍并重懸于該緩沖液，2-DOG濃度為0.5 mmol/L，考察pH對2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

1.2.3 試樣分析及數(shù)據(jù)處理

胞內(nèi)糖濃度采用離子色譜分析，實驗條件為PA10色譜柱和PA10保護(hù)柱，ED50電化學(xué)檢測器，流動相為18 mmol/L NaOH，流速1.0 mL/min，柱溫30℃。在此條件下，2-DOG、葡萄糖和木糖的保留時間分別為7.2、11.4和12.9 min。細(xì)胞干質(zhì)量的測定方法參照文獻(xiàn)［20］。數(shù)據(jù)處理采用軟件Origin 8.0。數(shù)據(jù)為2個試樣的平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

測定糖分子跨膜運(yùn)輸速率的方法受到多重因素影響，主要包括:試樣前處理過程的可重復(fù)性，進(jìn)入細(xì)胞后的代謝過程以及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性的穩(wěn)定性［19］。盡量縮短轉(zhuǎn)運(yùn)時間并采用不能被微生物代謝的類似物2-DOG，避免了代謝過程的影響。將細(xì)胞懸液于冰上保存，采取終點(diǎn)法記錄轉(zhuǎn)運(yùn)及過濾的總時間，用于計算糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率。通過采取上述措施，發(fā)現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)的重復(fù)性較好，為測定皮狀絲孢酵母單糖跨膜運(yùn)輸特性打下了基礎(chǔ)。

2.1 2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)

實驗結(jié)果表明，2-DOG跨膜運(yùn)輸速率在初始50 s內(nèi)保持穩(wěn)定，所以實驗選取30 s作為轉(zhuǎn)運(yùn)時間來考察。2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)如圖1所示。由圖1可知:2-DOG跨膜運(yùn)輸符合米氏動力學(xué)方程，經(jīng)非線性回歸計算，表觀米氏常數(shù)Km為0.19 mmol/L，最大速率Vmax為14.1 nmol/(min·mg)。飽和米氏動力學(xué)曲線表明是有載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制［21］。Eadie-Hofstee曲線呈線性，說明在此條件下可能僅存在1個2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)體系。

圖1 2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)(插圖為E-H曲線)Fig.1 Kinetics of 2-DOG transport(Inset，the E-H plot)

2.2 葡萄糖和2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系

考察葡萄糖對皮狀絲孢酵母2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)活性的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知:在沒有添加葡萄糖的條件下，2-DOG濃度為 0.1 mmol/L和 0.4 mmol/L所得到的2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)速率分別為(4.8±0.1)和(9.3±0.3)nmol/(min·mg)。隨著葡萄糖濃度升高，2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)速率降低。據(jù)圖2數(shù)據(jù)計算，當(dāng)2-DOG濃度為0.1 mmol/L、葡萄糖濃度達(dá)到0.28 mmol/L時，2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)速率降低50%;2-DOG濃度升高到0.4 mmol/L時，2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)速率降低50%所需葡萄糖濃度為0.65 mmol/L。由Dixon曲線可知，葡萄糖競爭性抑制2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)，表觀抑制常數(shù)Ki為0.26 mmol/L，表明葡萄糖和2-DOG共用一個轉(zhuǎn)運(yùn)體系，并且該轉(zhuǎn)運(yùn)體系對兩者的親和力相近。

圖2 葡萄糖對2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的影響(插圖為Dixon圖)Fig.2 Effects of glucose-mediated inhibition on 2-DOG transport(Inset，Dixon plot)

2.3 木糖對2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

將木糖與2-DOG同時作為底物考察皮狀絲孢酵母轉(zhuǎn)運(yùn)兩者的規(guī)律，結(jié)果見圖3。由圖3可知:當(dāng)2-DOG濃度分別為0.1和0.5 mmol/L時，沒有木糖的情況下，2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)速率分別為(4.1±0.1)和(8.4±0.2)nmol/(min·mg);添加1 mmol/L木糖后，2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)速率分別降低16%和3%。當(dāng)?shù)孜镏?-DOG濃度為0.1 mmol/L時，轉(zhuǎn)運(yùn)速率降低50%需要木糖12.7 mmol/L;底物中2-DOG濃度為0.5 mmol/L時，轉(zhuǎn)運(yùn)速率降低50%需要木糖20.5 mmol/L。由圖3還可知，木糖也競爭性抑制2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)，表明木糖和2-DOG共用同一個轉(zhuǎn)運(yùn)體系。木糖對2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀抑制常數(shù)Ki為10.3 mmol/L，遠(yuǎn)大于葡萄糖對應(yīng)的表觀抑制常數(shù)，說明該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對木糖的親和力遠(yuǎn)低于葡萄糖。

圖3 木糖對2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的影響(插圖為Dixon圖)Fig.3 Effects of xylose-mediated inhibition on 2-DOG transport(Inset，Dixon plot)

進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)積累2-DOG的同時也積累了大量木糖。由于胞內(nèi)2-DOG濃度高于胞外，推測2-DOG為主動運(yùn)輸過程。假設(shè)1.0 mg細(xì)胞干質(zhì)量相當(dāng)于2.0 μL胞內(nèi)水分［22］，計算所得數(shù)據(jù)如表1所示。由表1可知:木糖和2-DOG同時運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)，并且底物中木糖濃度越高，胞內(nèi)2-DOG濃度越低，胞內(nèi)木糖濃度也越高。當(dāng)?shù)孜镏心咎菨舛葹?0 mmol/L時，胞內(nèi)木糖濃度高達(dá)2-DOG濃度的18倍。此現(xiàn)象說明，雖然轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對木糖的親和力較低，但是木糖可能具有更高的Vmax［23］。由于發(fā)酵過程中底物遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量，其跨膜運(yùn)輸以較高速率進(jìn)行。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率接近2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的最大速率Vmax，即14.1 nmol/(min·mg)，而木糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率可能更高。由發(fā)酵實驗結(jié)果計算得知，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖和木糖濃度比為1∶1時，消耗速率分別為0.28 g/(L·h)和0.29 g/(L·h)［16］，比消耗速率分別為 1.1 和1.4 nmol/(min·mg)。所以，葡萄糖和木糖跨膜運(yùn)輸很可能不是限速步驟，因此發(fā)酵過程中2種底物的利用沒有明顯偏好性。

畢赤酵母Pichia heedii在利用葡萄糖和木糖時存在明顯的葡萄糖效應(yīng)［24］，木糖跨膜運(yùn)輸完全被葡萄糖抑制，但木糖不影響葡萄糖跨膜運(yùn)輸。所以，木糖與葡萄糖共運(yùn)輸，以及木糖抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是葡萄糖和木糖同步利用的前提條件。

表1 胞內(nèi)2-DOG和木糖濃度分析Table 1 Intracellular 2-DOG and xylose concentration at different extracellular xylose levels mmol·L －1

2.4 代謝抑制劑和pH對2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

質(zhì)子導(dǎo)體和代謝抑制劑能夠抑制質(zhì)子梯度的形成，從而抑制質(zhì)子/糖同向運(yùn)輸?？疾?種抑制劑對皮狀絲孢酵母轉(zhuǎn)運(yùn)糖特性的影響，結(jié)果見表2。由表2可知:4種抑制劑均對2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)存在明顯抑制作用，抑制能力從強(qiáng)到弱的順序為CCCP、疊氮化鈉、4-NP和 DCC。其中，CCCP濃度為 0.05 mmol/L就能抑制2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)活性的91%。2-DOG對代謝抑制劑的敏感性表明存在以質(zhì)子梯度為動力 的 糖 主 動 運(yùn) 輸 過 程［25］。 在 Hansenula polymorpha［26－27］， Kluyveromyces marxianus［28］和Rhodotorula gracilis［29］等酵母中也發(fā)現(xiàn)了同樣的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。S.cerevisiae中發(fā)現(xiàn)的主動運(yùn)輸過程也都屬于質(zhì)子同向運(yùn)輸體系［25，30］。

表2 抑制劑對2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Table 2 Effects of inhibitors on 2-DOG transport

質(zhì)子同向運(yùn)輸體系運(yùn)輸糖分子的過程對外界pH變化非常敏感［31－32］。圖4為pH對運(yùn)輸分子的影響結(jié)果。由圖4可知:當(dāng)以0.5 mmol/L 2-DOG為底物時，pH由8降低到4.6，轉(zhuǎn)運(yùn)速率逐步增大;pH為 4.6時，轉(zhuǎn)運(yùn)速率為 (7.5±0.1)nmol/(min·mg)。結(jié)果符合一般的質(zhì)子/糖同向運(yùn)輸機(jī)制，即質(zhì)子梯度是主動運(yùn)輸過程的主要推動力［26，33］。當(dāng) pH 為8時，暗示存在其他轉(zhuǎn)運(yùn)體系，而質(zhì)子同向運(yùn)輸體系在酸性條件下起主要作用。

圖4 外界pH對2-DOG轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Fig.4 Effect of external pH on 2-DOG transport

3 結(jié)論

在油脂酵母T.cutaneum中，葡萄糖和木糖與2-DOG共用同一個轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，經(jīng)驗證為質(zhì)子/糖同向運(yùn)輸體系。該酵母中，葡萄糖和木糖同步跨膜進(jìn)入胞內(nèi)，與以往報道的葡萄糖效應(yīng)菌株不同。分離獲得該轉(zhuǎn)運(yùn)體系的相關(guān)基因，對闡明同步利用機(jī)制、改造工業(yè)菌株以及木質(zhì)纖維素高效轉(zhuǎn)化有重要意義。

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