賀愛(ài)永，尹春燕，孔祥平，陳佳楠，姜 岷，吳 昊

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

丁醇是重要的C4平臺(tái)化合物之一，被廣泛應(yīng)用于各種精細(xì)化學(xué)品的制造中，同時(shí)是一種極具潛力的新型燃料［1－2］。在能源和糧食危機(jī)日益嚴(yán)峻的今天，面對(duì)國(guó)際能源安全和環(huán)境惡化的多重壓力，利用生物質(zhì)等可再生資源制備生物丁醇受到了廣泛的關(guān)注［3－5］。

生物丁醇發(fā)酵通常是利用產(chǎn)丁醇梭菌在嚴(yán)格厭氧條件下進(jìn)行的，其主要產(chǎn)物是丙酮、丁醇和乙醇，因此又被稱(chēng)為丙酮丁醇發(fā)酵，簡(jiǎn)稱(chēng)AB或ABE。傳統(tǒng)發(fā)酵中，丁醇、丙酮和乙醇的體積比約為6∶3∶1，同時(shí)還伴隨著副產(chǎn)物乙酸和丁酸，釋放 H2和CO2，導(dǎo)致底物的轉(zhuǎn)化利用率僅在 30% 左右［1，6］。因此，提高ABE中丁醇的含量，并有效改善底物的轉(zhuǎn)化率成為近年來(lái)丁醇發(fā)酵的又一大熱點(diǎn)。

目前，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和林業(yè)等產(chǎn)業(yè)中存在大量的木質(zhì)纖維原料的廢棄物，如秸稈、甘蔗渣和木屑等［7－8］，而這些木質(zhì)纖維原料可通過(guò)預(yù)處理、糖化處理分解成葡萄糖、木糖等多種糖分，用以發(fā)酵［9］。然而制糖過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生一些有機(jī)酸類(lèi)、糠醛類(lèi)和酚類(lèi)等抑制物，嚴(yán)重影響微生物的生長(zhǎng)與發(fā)酵［7］。目前為止，還沒(méi)有直接利用未脫毒的木質(zhì)纖維原料酸解糖液高效制備丁醇的菌株報(bào)道。C.beijerinckii BA101是已報(bào)道的利用葡萄糖為原料產(chǎn)溶劑最高的菌株，但是該菌株不能直接利用未脫毒的玉米纖維水解糖液發(fā)酵產(chǎn)丁醇［4］。筆者所在課題組利用N+離子束誘變篩選得到的C.beijerinckii IB4，能夠直接利用未脫毒的玉米芯水解液，其總?cè)軇┊a(chǎn)量?jī)H達(dá)9.5 g/L，其中丁醇 6.8 g/L［1］?；诖?，筆者通過(guò)清華大學(xué)研發(fā)的常壓室溫等離子體誘變(ARTP)育種機(jī)對(duì)拜氏梭菌進(jìn)行誘變，再經(jīng)高通量篩選平板復(fù)篩，以期選育出高抗逆、高丁比的丁醇生產(chǎn)菌株，并對(duì)其性能進(jìn)行考察，為進(jìn)一步選育極具工業(yè)化潛力的產(chǎn)丁醇梭菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

Clostridium beijerinckii IB4［1］，南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室選育保藏。

1.2 培養(yǎng)基和酸解糖液的制備

1)種子培養(yǎng)基(g/L) 酵母粉3，蛋白胨5，可溶性淀粉10，乙酸銨2，NaCl 2，MgSO43，KH2PO41，K2HPO41，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1;pH 6.0。

2)固體培養(yǎng)基 在種子培養(yǎng)基礎(chǔ)上再加瓊脂20 g/L。

3)平板篩選培養(yǎng)基 在固體種子培養(yǎng)基中添加刃天青0.02 g/L。

4)發(fā)酵培養(yǎng)基P2 C源(葡萄糖、木糖、蔗糖、混合糖(酸解糖液的模擬體系)和玉米芯酸解糖液，分消)，K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，CH3COONH42.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，NaCl 0.01 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，玉米漿 1 g/L。

以上培養(yǎng)基在121℃滅菌15 min后備用。

4)玉米芯酸解糖液的制備［10］將粉碎后過(guò)0.42 mm篩的玉米芯纖維在稀H2SO4水解的預(yù)處理?xiàng)l件下(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的稀H2SO4，反應(yīng)溫度125℃，預(yù)處理時(shí)間120 min，200 g/L的玉米纖維)得到的糖液，經(jīng)過(guò)Ca(OH)2中和pH至6.0，總還原糖約為55 g/L。其經(jīng)過(guò)121℃、15 min滅菌后的主要成分:總還原糖(55.2±1.6)g/L、木糖(44.6±0.9)g/L、葡萄糖(4.7±0.4)g/L、阿拉伯糖(3.32±0.3)g/L、可溶性總酚(TPC)(2.77±0.48)g/L、5-羥甲基糠醛(5-HMF)(0.38±0.04)g/L和糠醛(furfural)(0.66±0.11)g/L。

1.3 培養(yǎng)條件

1)活化培養(yǎng)條件 將1.5 mL種子甘油管，接種于50 mL血清瓶的種子培養(yǎng)基中，裝液30 mL，35℃厭氧培養(yǎng)12 h。

2)種子培養(yǎng)條件 將活化種子液按5%的比例轉(zhuǎn)接到100和500 mL血清瓶的種子培養(yǎng)基中，裝液分別為50 mL和300 mL，35℃厭氧培養(yǎng)12 h。

3)厭氧瓶發(fā)酵條件 將培養(yǎng)12 h后的種子液按10%的比例接種到100 mL血清瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量50 mL，35℃厭氧培養(yǎng)72 h。

4)發(fā)酵罐發(fā)酵條件 將培養(yǎng)12 h后的種子液按10%的比例接種5 L的KF-5L發(fā)酵罐(KoBio Tech.Co.Ltd)中，發(fā)酵培養(yǎng)基3 L，攪拌槳轉(zhuǎn)速100 r/min，接種后通N210 min，35℃厭氧培養(yǎng)至葡萄糖消耗完，定時(shí)取樣測(cè)定菌體密度(OD600)以及冷凍保存，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定試樣中的乙酸、丁酸和總?cè)軇舛取?/p>

1.4 選育方法

1)ARTP誘變 以He作為放電氣體，氣體流量QHe為10 L/min，射頻功率為100 W，等離子體發(fā)射源與菌膜之間的距離為2 mm，選用的時(shí)間范圍為10～240 s，然后將誘變后的菌液稀釋涂布至平板，計(jì)算其存活率。

2)高通量初篩 將洗脫后的菌液稀釋成不同濃度涂布于含刃天青的培養(yǎng)基平板上，35℃厭氧培養(yǎng)12 h。從選擇性平板中挑取變色圈較大，生長(zhǎng)較快的菌株，在固體種子培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)純化。

3)搖瓶復(fù)篩 將上述挑選的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，35℃厭氧培養(yǎng)12 h后，以10%的接種量接入含有總還原糖30 g/L玉米芯酸解糖液的P2發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過(guò)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選丁醇產(chǎn)量較高的突變株。對(duì)于發(fā)酵性能好的菌株進(jìn)行7次傳代實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.5 分析方法

1)菌體密度 利用752S紫外分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)，于600 nm處測(cè)定吸光值(OD600)。細(xì)胞干質(zhì)量(DCW)=0.26×菌體密度［1］。

2)糖濃度的測(cè)定 葡萄糖利用SBA 240C型生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定?？傔€原糖濃度采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法［11］測(cè)定。其他糖采用高效液相色譜法(HPLC)［12］測(cè)定。具體條件為Bio-Rad公司Aminex HPX-87H型離子排斥色譜柱(7.8 mm×300 mm)、檢測(cè)器為Shosex RI-101型示差折光檢測(cè)器、流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4溶液、進(jìn)樣體積 20 μL、流動(dòng)相流速0.6 mL/min、柱溫55℃。

3)總酚(TPC)的測(cè)定 具體方法參照文獻(xiàn)［13］。

4)產(chǎn)物(乙酸、丁酸及溶劑)檢測(cè) 采用FULI 9710氣相色譜儀(浙江福立分析儀器有限公司)，氫火焰離子化(FID)檢測(cè)器，色譜柱為石英毛細(xì)管柱(30 m ×0.32 mm ×1 μm，SE-30，交聯(lián)，最高使用溫度290℃)。柱箱溫度90℃，檢測(cè)器溫度180℃，進(jìn)樣器180℃，載氣為N2，流速30 mL/min，以異丁醇為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量。

5)計(jì)算方法

2 結(jié)果與討論

2.1 ARTP誘變條件的確定

ARTP誘變是通過(guò)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致基因斷裂，而通過(guò)細(xì)菌自身DNA修復(fù)發(fā)生基因突變，因此找到最合適的誘變條件才能夠?qū)崿F(xiàn)快速高效的誘變。而誘變時(shí)間的選擇通常是根據(jù)誘變存活率曲線(xiàn)(或死亡率曲線(xiàn))來(lái)確定的。根據(jù)前期的研究報(bào)道，當(dāng)存活率為10%左右時(shí)，具有較強(qiáng)的誘變效應(yīng)，通常以該時(shí)間作為最佳誘變時(shí)間［14－15］。

圖1為拜氏梭菌存活率曲線(xiàn)，誘變30 s時(shí)細(xì)胞存活率為42%;處理180 s，細(xì)胞存活率降至10%;處理240 s，基本無(wú)細(xì)胞存活。因此選用180 s作為最佳誘變時(shí)間。

圖1 Clostridium beijerinckii ARTP誘變存活率曲線(xiàn)Fig.1 Survival rate curve of plasma irradiated Clostridium beijerinckii cells

2.2 高通量篩選高抗逆高丁比突變株

C.beijerinckii經(jīng)ARTP誘變后，經(jīng)過(guò)刃天青平板涂布可快速、高效、便捷的篩選出透明圈大即還原力較強(qiáng)的突變菌株。最終，挑選出50株透明圈明顯大于出發(fā)菌株的突變菌。進(jìn)一步接種于含有總還原糖30 g/L玉米芯酸解糖液的P2發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過(guò)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)復(fù)篩。根據(jù)發(fā)酵結(jié)果選出5株對(duì)玉米芯酸解糖液中抑制物耐受能力強(qiáng)，丁醇比高的突變菌株，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知:IT111發(fā)酵發(fā)酵性能最好，總?cè)軇┊a(chǎn)量達(dá)到10.5 g/L，丁醇8.0 g/L，丁醇比高達(dá)76%，同時(shí)經(jīng)過(guò)6代傳代實(shí)驗(yàn)證明C.beijerinckii IT111發(fā)酵性能較為穩(wěn)定，甘油管－70℃保藏用以進(jìn)一步研究。

圖2 突變株與出發(fā)菌株總?cè)軇┖投〈籍a(chǎn)量的比較Fig.2 Comparison of the mutants and the original strain on the yield of solvents and butanol

2.3 C.beijerinckii突變菌株利用不同C源的發(fā)酵結(jié)果

C.beijerinckii 天然具有利用多種不同的單糖及多糖類(lèi)物質(zhì)的能力［3，5］。在以總糖為30 g/L的葡萄糖、木糖、蔗糖、混合糖及玉米芯酸解糖液為C源，發(fā)酵培養(yǎng)基中35℃搖瓶培養(yǎng)72 h，考察出發(fā)菌株及C.beijerinckii IT111對(duì)不同C源的代謝情況，結(jié)果如表1所示。由表1可知:30 g/L葡萄糖為C源時(shí)，C.beijerinckii IT111可以產(chǎn)生最高的總?cè)軇?13.6 g/L)，其中丁醇10.4 g/L，比例達(dá)到76%，分別較出發(fā)菌株提高了11.4%、16.9%和5.5%。其他C源與葡萄糖相比，利用率及轉(zhuǎn)化率都有所降低。而以蔗糖為C源時(shí)，C.beijerinckii IT111代謝產(chǎn)物丁醇比更是高達(dá)85%。值得一提的是，IT111利用混合糖和玉米芯酸解糖液的代謝能力相當(dāng)，說(shuō)明該突變菌株具有較強(qiáng)的抑制物抗逆性能。

表1 出發(fā)菌株和突變株利用不同C源的發(fā)酵結(jié)果Table 1 Fermentation results using different carbon sources as substrate by wild type and mutant

2.4 C.beijerinckii突變株對(duì)抑制物抗逆性能的考察

玉米芯等木質(zhì)纖維原料稀酸處理過(guò)程中產(chǎn)生多種抑制物，主要包含有機(jī)酸類(lèi)、糠醛類(lèi)和酚類(lèi)［7－9］。C.beijerinckii IB4 是目前報(bào)道可直接利用未脫毒玉米芯酸解糖液發(fā)酵制備丁醇的菌株［1］，該菌株對(duì)于木質(zhì)纖維素酸解糖液中抑制物成分具有較高的抗逆能力。

考察以1 g/L糠醛、5-HMF、甲酸鈉、乙酸鈉、NaCl和Na2SO4及0.5 g/L6種不同的模式酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)出發(fā)菌株IB4和C.beijerinckii IT111生長(zhǎng)及代謝的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知:酸類(lèi)及糠醛類(lèi)對(duì)C.beijerinckii生長(zhǎng)抑制影響較小，而酚類(lèi)物質(zhì)尤其是香草醛的抑制作用較明顯。當(dāng)香草醛的質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)，出發(fā)菌株IB4和突變株IT111的細(xì)胞干質(zhì)量濃度分別為0.7 g/L和1.1 g/L，分別比對(duì)照組降低了68%和52%。由圖3也可知:突變株的丁醇產(chǎn)量均高于出發(fā)菌株，當(dāng)糠醛和5-HMF的質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，C.beijerinckii IT111丁醇產(chǎn)量分別為9.0和9.1 g/L，比對(duì)照組的10.4 g/L略有降低，其丁醇抑制率分別為13%和12.5%。此外，當(dāng)加入4種鹽類(lèi)(乙酸鈉、甲酸鈉、NaCl和 Na2SO4)時(shí)，C.beijerinckii IT111的丁醇產(chǎn)量均大于9.9 g/L，丁醇抑制率均小于5%。6種模式酚類(lèi)對(duì)C.beijerinckii IT111發(fā)酵的影響差異較大，其中香草醛和丁香醛會(huì)使發(fā)酵延滯期延長(zhǎng)，從而使得發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)。盡管阿魏酸和香豆酸結(jié)構(gòu)相似，但香豆酸對(duì)發(fā)酵的抑制遠(yuǎn)高于阿魏酸。6種酚類(lèi)化合物中對(duì)C.beijerinckii IT111的丁醇產(chǎn)量影響最高是丁香醛(9.6 g/L丁醇)，丁醇產(chǎn)量最低的香草醛為4.5 g/L。

總體來(lái)說(shuō)，糠醛和酸類(lèi)對(duì)C.beijerinckii發(fā)酵影響較小，酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)C.beijerinckii抑制作用較強(qiáng)，其中以香草醛為最。

圖3 不同抑制物對(duì)出發(fā)菌株和突變株C.beijerinckii IT111的生長(zhǎng)和代謝的影響Fig.3 Effects of inhibitors on cell growth and butanol production by the original strain and C.beijerinckii IT111

3 結(jié)論

1)通過(guò)ARTP誘變及高通量篩選選育到一株生產(chǎn)性能優(yōu)良的產(chǎn)丁醇拜氏梭菌IT111。

2)C.beijerinckiiIT111利用多種C源時(shí)均展現(xiàn)其高丁醇比的特性，以玉米芯酸解糖液為C源時(shí)，溶劑產(chǎn)量達(dá)到10.5 g/L，丁醇8.0 g/L，丁醇比高達(dá)76%。

3)糠醛和酸類(lèi)對(duì)C.beijerinckii發(fā)酵影響較小，酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)C.beijerinckii抑制作用較強(qiáng)，其中以香草醛為最。

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