林良才，李金根，王 邦，裴 雪，2，田朝光

(1.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308;2.吉林大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062)

絲狀真菌粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)又稱粗糙脈孢霉(以下簡(jiǎn)稱脈孢菌)，作為生物遺傳學(xué)模式生物已有近百年的研究歷史，其中“一種基因一種酶學(xué)說”獲得了1958年諾貝爾獎(jiǎng)。作為天然的纖維素快速降解菌，粗糙脈孢菌可以快速降解木質(zhì)纖維素，并具有利用木糖、纖維二糖、寡糖等組分的能力，有關(guān)脈孢菌降解木質(zhì)纖維素及其纖維素酶的研究早在1950年就有相關(guān)報(bào)導(dǎo)［1］。20世紀(jì)70年代第3次石油危機(jī)時(shí)，就掀起了一個(gè)研究脈胞菌纖維素酶和半纖維素酶的小高潮，不僅對(duì)脈孢菌產(chǎn)纖維素酶的條件、纖維素酶及半纖維素酶酶活性質(zhì)進(jìn)行了研究［2-3］，而且深入探討了利用脈孢菌直接發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的可能性［4］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，20世紀(jì)90年代初期，脈孢菌纖維素的外切酶cbh-1首次被克隆、測(cè)序［5］。在我國(guó)，最早利用脈孢菌開展纖維素酶研究的是山東大學(xué)曲音波教授，其團(tuán)隊(duì)先后對(duì)脈孢菌產(chǎn)纖維素酶及其木糖發(fā)酵進(jìn)行了系統(tǒng)研究［6-7］。此外，天津理工大學(xué)馮炘教授針對(duì)脈孢菌發(fā)酵纖維素酶過程優(yōu)化進(jìn)行了深入研究［8］。近年來，伴隨著轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等組學(xué)技術(shù)的興起，脈孢菌纖維素降解機(jī)制和應(yīng)用的研究再次成為熱點(diǎn)，并取得了多個(gè)方面的顯著進(jìn)展，包括從組學(xué)水平系統(tǒng)研究纖維素降解過程、多糖單加氧酶(PMO)(GH61)家族在纖維素降解中功能、纖維素酶表達(dá)調(diào)控以及生物質(zhì)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的研究等。本文中筆者將就這些方面進(jìn)行重點(diǎn)綜述。

1 粗糙脈孢菌木質(zhì)纖維素降解全基因組水平研究

組學(xué)技術(shù)的興起將真菌木質(zhì)纖維素降解的研究迅速提升到全基因水平。一批重要的木質(zhì)纖維素降解真菌的基因組相繼被測(cè)序。脈孢菌是第一個(gè)被測(cè)序的絲狀真菌［9］，隨后公布了里氏木霉(Trichoderma reesei)的基因組數(shù)據(jù)［10］。比較基因組學(xué)分析顯示，脈孢菌含有的纖維素酶數(shù)目是里氏木霉的兩倍之多，同時(shí)還擁有諸多半纖維素酶和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子［10］。2009 年，Tian 等［11］以脈孢菌為研究對(duì)象，利用豐富的突變體庫(kù)，綜合運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，首次對(duì)纖維素降解真菌進(jìn)行了全基因組學(xué)水平的系統(tǒng)研究。基因差異分析顯示，脈孢菌在芒草秸稈培養(yǎng)基上有700多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本表達(dá)顯著變化(相比于蔗糖培養(yǎng)基)。其中在23個(gè)預(yù)測(cè)的纖維素酶基因中有18個(gè)快速顯著上調(diào);在預(yù)測(cè)的19個(gè)半纖維素基因中有13個(gè)顯著上調(diào)。同時(shí)，一些轉(zhuǎn)錄因子、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及未知功能蛋白也被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。通過對(duì)胞外分泌蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，確證了10個(gè)纖維素酶和8個(gè)半纖維素酶。這些組學(xué)研究結(jié)果為后續(xù)挖掘新型纖維素降解酶系以及遺傳改造脈孢菌提供了豐富的數(shù)據(jù)。隨后，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校Louise Glass實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)以脈孢菌為對(duì)象，對(duì)半纖維素降解調(diào)控進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和分泌蛋白組水平的研究［12］。除鑒定了353個(gè)基因在木聚糖條件下顯著上調(diào)表達(dá)以及34個(gè)胞外分泌蛋白以外，還證明了xlr-1(NCU06971)是脈孢菌主要的半纖維素酶基因表達(dá)正調(diào)控因子，指明xlr-1對(duì)半纖維素降解調(diào)控作用普遍存在于脈孢菌、里氏木霉、黑曲霉等纖維素降解真菌中。Schmoll等［13］發(fā)現(xiàn)光感受基因wc-1/2(white collar)及vvd參與了纖維素酶表達(dá)調(diào)控。研究指出，WC-1/2組成的復(fù)合物WCC(white collar complex)在脈孢菌生長(zhǎng)早期負(fù)調(diào)控纖維素酶表達(dá)，但是隨著vvd感受光刺激產(chǎn)生光適應(yīng)，WCC活性被抑制，進(jìn)而增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)纖維素的利用能力。值得注意的是，wc基因除了形成復(fù)合物間接對(duì)纖維素酶表達(dá)起調(diào)控作用之外，還能分別獨(dú)立地間接負(fù)調(diào)控纖維素酶表達(dá)，但其具體的調(diào)控通路仍不明晰。此外，伯克利分校的 Phillips等［14］實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用蛋白質(zhì)譜定量技術(shù)，首次對(duì)脈孢菌在微結(jié)晶纖維素上的分泌蛋白做了定量分析，測(cè)定了胞外分泌纖維素酶的成分比例。結(jié)果顯示，CBH-1(NCU07340)、 GH6-2(NCU09680)、 GH5-1(NCU00762)和GH3-4(NCU04952)是脈孢菌最主要的纖維素酶系成分，占到胞外蛋白總質(zhì)量的63%～65%。隨后，對(duì)這4種酶進(jìn)行了cocktail配比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)比例趨勢(shì)基本符合脈孢菌本源的分泌蛋白組。然而，這個(gè)最優(yōu)配比的纖維素酶系的酶活只能達(dá)到本源分泌酶混合物的43%，由此推測(cè)纖維素酶水解促進(jìn)蛋白(包括PMO、纖維二糖脫氫酶(CDH)等)也起著不可忽略的作用。充分利用脈孢菌全基因組突變體庫(kù)和功能基因組學(xué)工具，開展纖維素降解途徑新基因和新蛋白的挖掘，必將大大加深對(duì)木質(zhì)纖維素降解和纖維素酶表達(dá)分泌的基因組水平的理解。

2 粗糙脈孢菌PMO家族纖維素酶研究

纖維素降解是通過內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡糖苷酶3種酶協(xié)同作用完成。基因組預(yù)測(cè)顯示，脈孢菌含有10個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶、6個(gè)外切葡聚糖酶和7個(gè)β-葡萄糖苷基因。早在20世紀(jì)50年代，Reese等［15］就提出可以通過添加一種能破壞底物聚合結(jié)構(gòu)的非水解組分來提高纖維素酶的降解效率，促進(jìn)纖維素的水解。PMO家族的酶就具有這種功能，該家族蛋白是銅依賴的溶解多糖單加氧酶，具有較弱的內(nèi)切葡聚糖酶酶活，其與CDH結(jié)合可增強(qiáng)纖維素酶的水解能力，如GH61家族蛋白。在商業(yè)化的纖維素酶中添加少量的該家族的蛋白即可顯著提高對(duì)纖維素的降解作用，故在木質(zhì)纖維素糖化產(chǎn)業(yè)化中有巨大的應(yīng)用前景，也是近年來的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

迄今為止，在很多纖維素降解真菌中都發(fā)現(xiàn)了pmo基因，脈胞菌基因組中有14個(gè) pmo基因。Phillips等［14］對(duì)N.crassa在微晶纖維素上生長(zhǎng)所分泌的胞外蛋白進(jìn)行定量分析，檢測(cè)到4個(gè)PMO蛋白，共占分泌蛋白總量的15%。由此可以推斷，無論是從該家族基因數(shù)量還是其分泌量都可看出PMO家族蛋白在纖維素降解過程中發(fā)揮著重要的作用。

Phillips 等［14］、Beeson 等［16］通過對(duì)脈孢菌中的PMO家族蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，該家族蛋白的N-端有保守的氨基酸結(jié)構(gòu)域以及2個(gè)與金屬離子相結(jié)合的保守的組氨酸位點(diǎn)。PMO家族的酶通過與CDH或者一些低相對(duì)分子質(zhì)量的還原劑(如抗壞血酸)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，氧化纖維素、破壞糖苷鍵、裂解纖維素鏈上的不同部位C原子(C-1、C-4和C-6)，進(jìn)而達(dá)到裂解纖維素的目的［17］。Beeson 等［16］的研究表明 PMO-5 氧化裂解纖維素作用位點(diǎn)位于纖維素鏈上的C-1位置，而PMO-4則是作用在C-4和C-6位置。

Kittl等［17］在 Picha pastoris中表達(dá)了 N.crassa的4個(gè)PMO家族蛋白，分別是PMO3、PMO5、PMO6和PMO10，其中PMO-3、PMO-5和PMO-10具有碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)結(jié)構(gòu)域。通過對(duì)N.crassa在芒草上的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析顯示，PMO-5表達(dá)水平提高了107倍，PMO-3提高了85倍，PMO-6上調(diào)了26倍，而PMO-10表達(dá)水平幾乎沒有變化。在P.pastoris中重組表達(dá)后證實(shí)，這些酶為銅依賴的PMO，并且CDH可以有效提高其活性，可以促進(jìn)纖維素的氧化裂解。然而，已公布的80%的PMO家族蛋白的序列在C端都不具有纖維素結(jié)合域。Harris等［18］指出是否存在該結(jié)構(gòu)域與其增加纖維素水解的能力無關(guān);同時(shí)也指出在加入Ca2+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Ni2+和 Zn2+時(shí)，PMO 家族蛋白可顯著提高纖維素酶對(duì)底物的水解能力;然而當(dāng)不含有這些金屬離子時(shí)，添加PMO家族蛋白對(duì)纖維素酶的水解能力無顯著影響。同時(shí)，Quinlan等［19］通過研究Thermoascusaurantiacus中的 PMO家族蛋白(TaGH61A)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)存在沒食子酸(gallic acid)等電子供體的情況下，該蛋白可促進(jìn)纖維素的氧化裂解。Kittl等［17］也在N.crassa中證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

由于PMO家族蛋白可以加速纖維素酶對(duì)生物質(zhì)的降解，從而降低纖維素酶的用量，并縮短其反應(yīng)時(shí)間，因此PMO家族蛋白的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用將會(huì)對(duì)木質(zhì)纖維素的利用、轉(zhuǎn)化發(fā)揮重要的作用。在T.reesei中共表達(dá)一個(gè)高活性的PMO蛋白能夠使其纖維素酶活提高2倍［19］。諾維信公司(Novozymes)生產(chǎn)的一個(gè)高效纖維素酶Cellic?CTec2中就添加了PMO蛋白，其酶活相對(duì)于之前的產(chǎn)品就有了顯著的提高［20］。PMO家族基因的開發(fā)與利用可有效提高纖維素酶活，并且減少纖維素酶的用量，未來如果能夠大規(guī)模應(yīng)用，將有助于進(jìn)一步降低生物糖化成本，從而促進(jìn)生物質(zhì)資源的有效利用。

3 纖維素酶表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展

纖維素酶是在胞內(nèi)表達(dá)合成后經(jīng)分泌系統(tǒng)分泌至胞外的，而誘導(dǎo)纖維素酶合成的天然底物是不溶性的，無法進(jìn)入胞內(nèi)產(chǎn)生誘導(dǎo)表達(dá)響應(yīng)，因此它如何產(chǎn)生誘導(dǎo)作用成為了關(guān)注的熱點(diǎn)?；趯?duì)一些寡糖及其衍生物如纖維二糖、δ-纖維二糖內(nèi)酯、乳糖和槐糖對(duì)纖維素酶表達(dá)合成具有強(qiáng)信號(hào)誘導(dǎo)作用的研究認(rèn)識(shí)，通常認(rèn)為木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)生的寡糖及其衍生物是作為事實(shí)上的誘導(dǎo)底物，產(chǎn)生信號(hào)分子，進(jìn)一步誘導(dǎo)木質(zhì)纖維素酶系基因的大量表達(dá)［21］?；碧鞘怯搔?1，2糖苷酶連接的葡萄糖組成，能夠誘導(dǎo)高水平的纖維素酶表達(dá)，通常被認(rèn)為是極佳的天然可溶誘導(dǎo)物［22-23］，尤其是在 T.reesei中，通常認(rèn)為它是由纖維二糖在β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基作用形成的［24］。纖維二糖是纖維素降解中的重要可溶性中間產(chǎn)物，能夠產(chǎn)生信號(hào)分子，誘導(dǎo)纖維素酶的表達(dá)，被認(rèn)為是纖維素酶表達(dá)的自然誘導(dǎo)物，但纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶的分子水平機(jī)制尚不清楚。在通常條件下，纖維二糖被β-葡萄糖苷酶降解成為葡萄糖，并且引起阻遏效應(yīng)，其對(duì)纖維素酶的誘導(dǎo)作用無法體現(xiàn)。粗糙脈孢菌通過敲除 3個(gè)主 要 的 β-葡 萄 糖 苷 酶(NCU00130、NCU04952和NCU08755)可以實(shí)現(xiàn)在纖維二糖條件下直接表達(dá)纖維素酶。突變體Δ3βG在纖維二糖的誘導(dǎo)條件下其蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的響應(yīng)與野生型菌株在纖維素誘導(dǎo)條件下的響應(yīng)相類似。由此推測(cè)，其他纖維素降解絲狀真菌的β-葡萄糖苷酶缺失菌株可以直接以可溶性的纖維二糖作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)纖維素酶。

近年來，對(duì)纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控研究主要集中在木霉、曲霉等工業(yè)微生物上［25］(圖1)。目前已知的調(diào)控基因有轉(zhuǎn)錄激活因子XInR［26-29］、轉(zhuǎn)錄抑制因子Ace1［30-31］、激 活 因 子 Ace2［32-34］、葡 萄 糖 阻 遏 蛋 白Cre1［35-36］、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子 PacC［37-39］、CCAAT 結(jié)合復(fù)合體 Hap2/3/5［40-42］和 GATA 因子 AreA［43-44］。在曲霉和木霉中，轉(zhuǎn)錄因子XlnR/XYR1對(duì)纖維素酶和半纖維素酶具有重要的調(diào)控作用。然而，XlnR/XYR1在脈孢菌和鐮刀霉中的同源基因并不是纖維素酶表達(dá)所必須的，它們是菌體利用半纖維素所必需的，并且調(diào)控半纖維素酶的表達(dá)。加州大學(xué)伯克利分校Glass實(shí)驗(yàn)室對(duì)200多個(gè)粗糙脈孢菌轉(zhuǎn)錄因子敲除菌株在纖維二糖上進(jìn)行了生長(zhǎng)和酶活力檢測(cè)的篩選，獲得了2個(gè)在子囊真菌中較保守的Zn(Ⅱ)2Cys6家族轉(zhuǎn)錄因子clr-1和clr-2，研究結(jié)果表明這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是所有主要的纖維素酶基因和大部分半纖維酶基因誘導(dǎo)表達(dá)所必須的轉(zhuǎn)錄因子［45］。突變株Δclr-1和Δclr-2喪失了在纖維素條件下表達(dá)、分泌纖維素酶的能力。然而，這2個(gè)突變株在木聚糖條件下依舊可以正常地生長(zhǎng)和分泌半纖維素酶。由此推測(cè)，在一些纖維素降解絲狀真菌中，纖維素酶和半纖維素酶的表達(dá)調(diào)控相互獨(dú)立，而clr-1和clr-2正是粗糙脈孢菌纖維素酶表達(dá)調(diào)控的重要組成部分。纖維二糖及其轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物作為纖維素酶最初的誘導(dǎo)物。在纖維二糖或是其轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物的誘導(dǎo)下，clr-1被激活，促進(jìn)一系列可有效利用纖維二糖的基因表達(dá)，如clr-2等。clr-2可以進(jìn)一步直接誘導(dǎo)纖維素酶和某些半纖維素酶的表達(dá)。在構(gòu)巢曲霉中，誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)所需的是clrB(clr-2的同源基因)，而不是clrA(clr-1的同源基因)。然而，clrA的缺失將導(dǎo)致構(gòu)巢曲霉利用纖維二糖的能力的喪失。因此，clr-1/clrA在絲狀真菌纖維二糖感受途徑中具有重要的保守作用。

圖1 絲狀真菌中參與纖維素酶調(diào)控機(jī)制示意［25］Fig.1 Schematic representation of the different fungal trans-acting factors and regulatory responses affecting cellulase expression［25］

轉(zhuǎn)錄因子clr-1和clr-2都屬于鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子超家族，鋅指蛋白是一類具有手指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、增強(qiáng)植物抗逆性等方面具有重要的作用，該家族蛋白最初于1983年在非洲爪蟾卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子TFⅢA中被發(fā)現(xiàn)［46-47］，是迄今在真核生物基因組中分布最廣的一類蛋白，也是真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子中最大的家族之一。鋅指蛋白可以根據(jù)高度保守的氨基酸序列分為三大類:①經(jīng)典鋅指蛋白Cys2His2型，是真核生物中最為普遍存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通常以單體的形式與核酸相互作用，如人的轉(zhuǎn)錄因子Sp1、曲霉的碳代謝阻遏調(diào)控因子creA;②Cys4型鋅指蛋白，與Cys2His2型不同，以二聚體的形式與DNA相作用，其同源二聚體識(shí)別目標(biāo)基因的反向重復(fù)序列，異源二聚體可以與正向重復(fù)序列相結(jié)合;③C6型鋅指又稱鋅簇或鋅雙核簇(Zn(Ⅱ)2Cys6或Zn2C6)，包含一個(gè)由6個(gè)半胱氨酸圍繞著2個(gè)鋅離子而形成的DNA結(jié)合域。值得指出的是，該鋅指家族蛋白是真菌所特有的轉(zhuǎn)錄因子，其可以與DNA以單體、同源二聚體或異源二聚體形式結(jié)合［48］。

筆者通過對(duì)粗糙脈孢菌鋅指蛋白超家族轉(zhuǎn)錄因子敲除突變體庫(kù)的進(jìn)一步系統(tǒng)篩選，獲得了多個(gè)與纖維素酶表達(dá)異常的突變體。研究表明，在以結(jié)晶纖維素作為唯一C源的條件下，有3株突變體的蛋白分泌量和纖維素酶活力顯著上升，而顯著下降的有2株(未發(fā)表)。目前，正在深入研究這些潛在的基因?qū)w維素酶表達(dá)、分泌的調(diào)控機(jī)制以及與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之間的關(guān)系。這些重要的轉(zhuǎn)錄因子功能的揭示將有助于對(duì)絲狀真菌木質(zhì)素降解途徑的認(rèn)識(shí)，更有利于形成高產(chǎn)纖維素酶的工程菌株，從而提高木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的利用效率。

4 生物質(zhì)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白克隆鑒定及其在生物質(zhì)乙醇發(fā)酵中的應(yīng)用

作為木質(zhì)纖維素主要成分，纖維素和半纖維素是多種單糖分子聚合而成的復(fù)雜高聚碳水化合物，通過復(fù)合酶系可以水解為各種單糖和寡糖(圖2)。而對(duì)水解產(chǎn)物的利用，是纖維素轉(zhuǎn)化為生物燃料和化學(xué)品的重要研究?jī)?nèi)容。特別是關(guān)于木質(zhì)纖維素降解真菌，是如何將降解的單糖和寡糖運(yùn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)運(yùn)的過程如何受到細(xì)胞內(nèi)外因素的調(diào)控以及不同的糖分子如何被特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)，這些方面的研究仍然非常薄弱。深入研究纖維素降解真菌(包括脈孢菌)對(duì)纖維素的利用，對(duì)于理清纖維素降解機(jī)制及糖到化學(xué)品的微生物轉(zhuǎn)化都十分必要。

從脈孢菌在纖維素和半纖維素條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)出發(fā)，已經(jīng)先后克隆了脈孢菌的3個(gè)非常重要的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 CDT1(NCU00801)，CDT2(NCU08114)和An25(NCU00821)。其中，CDT1和CDT2為纖維寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，An25為木糖特異的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。CDT1自被克隆以來，在纖維二糖發(fā)酵以及與木糖、半乳糖等戊糖共發(fā)酵方面取得了顯著進(jìn)展，這方面工作主要來自美國(guó)伊利諾伊大學(xué)金永株(Yong-su Jin)實(shí)驗(yàn)室和趙惠民實(shí)驗(yàn)室。他們?cè)谀馨l(fā)酵木糖的酵母中引入脈孢菌的CDT1和胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶(NCU04952)，構(gòu)建出能夠同時(shí)利用纖維二糖和木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的工程酵母，而胞內(nèi)水解纖維二糖的策略也大大減緩了胞外葡萄糖產(chǎn)生的阻遏效應(yīng)［49-50］?；谙嗤乃悸?，金永株實(shí)驗(yàn)室還構(gòu)建了纖維二糖/半乳糖共發(fā)酵的工程酵母，拓寬了酵母發(fā)酵的底物譜［51］。最近，趙慧民實(shí)驗(yàn)室采用纖維二糖代謝途徑定向進(jìn)化的策略，大大提高了酵母利用纖維二糖的能力，同時(shí)將乙醇產(chǎn)量提高到1 g/L/h［52］。此外，研究者也嘗試用含纖維素酶cocktail和含 CDT1的酵母做 CBP(consolidated bioprocess)產(chǎn)乙醇［53］，以及利用纖維二糖發(fā)酵產(chǎn)其他化學(xué)品［54-55］?？偟恼f來，脈孢菌高親和性纖維寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定與應(yīng)用極大地促進(jìn)了混合糖發(fā)酵的研究，為纖維素乙醇及其他纖維素化學(xué)品發(fā)酵提供了新的思路和工程改造靶點(diǎn)。

圖2 粗糙脈孢菌中參與降解木質(zhì)纖維素的各種酶系［45］Fig.2 Characterized enzyme classesinvolved in lignocelluloses breakdown identified in the N.crassa genome［45］

在五碳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白方面，過去的研究多集中在利用己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等底物廣譜性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來轉(zhuǎn)運(yùn)五碳糖，而對(duì)于特異性五碳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(pentose specific transporter)的研究才剛剛起步。美國(guó)伊利諾伊大學(xué)趙慧民教授實(shí)驗(yàn)室分別從粗糙脈孢菌和畢赤酵母中鑒定了2個(gè)木糖特異轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(An25和Xyp29)［56］。作為半纖維素的主要成分之一，阿拉伯糖的利用對(duì)木質(zhì)纖維素徹底轉(zhuǎn)化利用至關(guān)重要，國(guó)際上關(guān)于阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究逐漸開始涉及。2011年，芬蘭VTT研究中心Richard實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家從Ambrosiozyme monospora酵母中克隆2個(gè)阿拉伯糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)基因(LAT1，LAT2)，但該阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親和力不高［57］，尋找親和力更高的阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是研究阿拉伯糖轉(zhuǎn)化利用的核心問題之一。

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)和序列結(jié)構(gòu)域分析，目前脈孢菌全基因組被預(yù)測(cè)有39個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(未發(fā)表數(shù)據(jù))，基本屬于膜蛋白家族MFS(major facilitator superfamily)［58］。依據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制，MFS 又分為簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(uniporter)(又稱協(xié)助擴(kuò)散蛋白(facilitateddiffusion protein)、同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(symporter)以及反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(antiporter)。Uniporter，依靠底物濃度梯度驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要起著協(xié)助運(yùn)輸?shù)淖饔?。Symporter，向同一個(gè)方向同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)2種及以上的底物，并以其中一種底物的電化學(xué)梯度作為推動(dòng)力，常見的有 sugar/H+、glucose/Na+、phosphate/H+、nucleoside/H+以 及nitrate/H+等等。Antiporter，向反方向協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)2種及以上的底物，驅(qū)動(dòng)力來源和Symporter一樣，這一類里很多都是drag/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。真菌中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要是uniporter和symporter/H+類型［58］。早在1974年已有報(bào)道指出，脈孢菌在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)糖進(jìn)入細(xì)胞的同時(shí)會(huì)協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子［59］，但在分子水平上哪些糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用導(dǎo)致表觀上電勢(shì)的變化至今仍沒有被闡釋。此外，由于自然界中脈孢菌能生長(zhǎng)在樹枝、秸稈等各種干枯的木質(zhì)纖維上，可以預(yù)見其糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族具有很高的功能多樣性。同時(shí)，在長(zhǎng)期的進(jìn)化適應(yīng)過程中，細(xì)胞面對(duì)不同的生長(zhǎng)環(huán)境，如酸性-堿性、碳充足-碳匱乏，會(huì)有很好的策略來協(xié)同這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的轉(zhuǎn)運(yùn)工作，以使得其能高效地吸收外界的營(yíng)養(yǎng)。全基因組系統(tǒng)解析絲狀真菌中糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白動(dòng)力類型和生化特征，對(duì)于研究絲狀真菌環(huán)境適應(yīng)性，理清纖維素降解菌利用木質(zhì)纖維素的機(jī)制有重要意義。更進(jìn)一步地，這種高效的糖轉(zhuǎn)運(yùn)吸收方式，有可能對(duì)改造工程菌(包括酵母、曲霉和木霉)以充分利用培養(yǎng)基中的殘?zhí)前l(fā)酵，提高糖的轉(zhuǎn)化利用率有一定的指導(dǎo)意義。

5 粗糙脈孢菌與生物質(zhì)一步轉(zhuǎn)化

生物質(zhì)具有成本低、可再生以及產(chǎn)量大等特點(diǎn)，是生產(chǎn)生物燃料及化學(xué)品的重要原料。利用生物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵一般要經(jīng)過預(yù)處理、酶解、發(fā)酵以及最后產(chǎn)品的分離純化。其中，預(yù)處理和酶解過程是整個(gè)過程中成本最重的部分。盡管木霉、曲霉和白腐菌等木質(zhì)纖維素降解真菌已被廣泛地應(yīng)用于生物質(zhì)纖維素預(yù)處理和生產(chǎn)纖維素酶過程中。目前為止，直接利用它們將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖或是化學(xué)品卻未見報(bào)道。因此，如何直接利用廉價(jià)的生物質(zhì)作為底物生產(chǎn)清潔能源或是工業(yè)化學(xué)品成為了今后研究的發(fā)展方向。粗糙脈孢菌作為絲狀真菌的模式菌株不僅具有降解木質(zhì)纖維素所需的酶系，而且還能夠利用降解產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等化學(xué)品［7］。這種直接從初始的生物質(zhì)原料一步發(fā)酵生產(chǎn)生物產(chǎn)品的工藝將極大地降低生產(chǎn)成本，并且大幅提高生物質(zhì)中的碳轉(zhuǎn)化效率。

脈孢菌能夠利用生物質(zhì)降解物中的各種糖類(葡萄糖、木糖及阿拉伯糖等)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等。張瀟等［7］研究了不同條件對(duì)脈孢菌AS3.1602木糖發(fā)酵的影響，研究表明脈孢菌具有較強(qiáng)的發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇及木糖醇的能力。在木糖發(fā)酵中，乙醇及木糖醇等產(chǎn)物產(chǎn)率很大程度上決定于通氧條件、培養(yǎng)基初始pH值及糖濃度等環(huán)境因素。由于輔因子的不同，真菌中木糖代謝具有氧化還原不平衡的特點(diǎn)。Zhao等［60］經(jīng)過研究證明，在脈孢菌中存在2種木糖還原酶的同工酶(EI和EII)，其中木糖還原酶EII能夠同時(shí)利用NADH與NADPH作為輔因子催化氧化還原反應(yīng)，從而有助于減緩細(xì)胞內(nèi)氧化還原不平衡，促進(jìn)的木糖的代謝，進(jìn)而提高發(fā)酵效率。Zhang等［61］探討了在限氧條件下脈孢菌的木糖代謝，在最佳通氧條件，乙醇產(chǎn)量達(dá)到6.7 g/L，轉(zhuǎn)化率為66%。

脈孢菌發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇一般要經(jīng)過兩個(gè)階段:第一階段在有氧條件下，分泌降解纖維素的各種酶類;第二階段，在厭氧或微好氧條件下，將水解產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。Xiros等［62］將脈孢菌DSM 1129在高粱殘?jiān)腆w中培養(yǎng)，而后在厭氧或微好氧條件下進(jìn)行液體發(fā)酵，其乙醇產(chǎn)量為75 g/L，研究表明用堿液對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理有利于乙醇產(chǎn)量的提高，且產(chǎn)生的潛在抑制物對(duì)發(fā)酵無抑制作用。Okonko等［63］報(bào)道了脈孢菌在37℃下經(jīng)過可以直接發(fā)酵甘蔗渣生產(chǎn)乙醇。

除了纖維素乙醇工藝的整合之外，Wu等［64］通過有性雜交得到β-葡萄糖苷酶的六突變體，其中菌株F5能夠降解纖維素積累纖維二糖(7.7 g/L)。在過量表達(dá)纖維二糖脫氫酶的情況下，菌株F5能夠利用纖維素發(fā)酵生產(chǎn)纖維二糖酸(0.4 g/L)及纖維二糖(6.5 g/L)，從而將纖維素酶的酶的生產(chǎn)和酶解過程進(jìn)行整合。

此外，脈孢菌體內(nèi)還存在豐富的蛋白質(zhì)、維生素B12及脂類等，同時(shí)還具有良好的蛋白表達(dá)、分泌能力，然而利用木質(zhì)纖維素直接發(fā)酵生產(chǎn)這些高附加值產(chǎn)品還有待進(jìn)一步的研究。

6 展望

粗糙脈孢菌作為纖維素降解模式真菌，在國(guó)際上有較大的研究群體，在技術(shù)方法和文獻(xiàn)資源上具有其他真菌所沒有的優(yōu)勢(shì)，使得脈孢菌纖維素降解機(jī)理研究能夠在真菌中處于領(lǐng)先地位?？梢灶A(yù)見，除了已經(jīng)取得進(jìn)展之外，未來幾年，利用粗糙脈孢菌系統(tǒng)在木質(zhì)纖維素降解利用方面的研究將會(huì)有更大進(jìn)展。美國(guó)伯克利能源生命科學(xué)研究所(EBI)重點(diǎn)以粗糙脈孢菌系統(tǒng)為依托，部署了一系列的研究項(xiàng)目(表1)。在該方向正在開展的8個(gè)項(xiàng)目(Program)中有4個(gè)涉及粗糙脈孢菌體系，其中2個(gè)主要研究粗糙脈孢菌(蛋白分泌途徑和木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化生物燃料)，另外2個(gè)利用粗糙脈孢菌研究果膠降解組學(xué)和纖維素酶系的表達(dá)篩選。此外，在該方向14個(gè)資助課題(Project)中有3個(gè)是粗糙脈孢菌研究(脂肪酸合成，代謝組學(xué)重構(gòu)和生物質(zhì)降解機(jī)制)。預(yù)計(jì)該系列研究將帶動(dòng)整個(gè)脈孢菌在木質(zhì)纖維素降解機(jī)制，蛋白質(zhì)合成分泌等方面取得新一輪進(jìn)展，同時(shí)也表明粗糙脈孢菌木質(zhì)纖維素降解利用研究競(jìng)爭(zhēng)會(huì)更加激烈，包括機(jī)理研究和利用該菌進(jìn)行纖維素酶生產(chǎn)、蛋白表達(dá)系統(tǒng)開發(fā)以及燃料化學(xué)品生產(chǎn)等方面。

表1 EBI木質(zhì)纖維素降解領(lǐng)域資助的有關(guān)粗糙脈孢菌的項(xiàng)目和課題Table 1 Long-term programs and short-term projects in cellulose degradation supported by Energy Biosciences Institute(EBI)

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