司冠儒，徐美娟，饒志明

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122)

脂 肪 酶 (lipase，EC3.1.1.3，triacylglycerol acylhydrolase)，又稱(chēng)三?；视退饷浮Ｄ艽呋馊８视蜕芍舅?、二酸甘油酯、單酸甘油酯以及甘油，其天然底物一般是不溶于水溶液的長(zhǎng)鏈脂肪酸?；?。粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶以其獨(dú)特的性質(zhì)廣泛應(yīng)用于食品加工、生物醫(yī)藥和生物柴油等領(lǐng)域［1－2］。朱綺霞等［3－4］篩選到 1 株產(chǎn)脂肪酶的粘質(zhì)沙雷氏菌，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)酶條件，使其比酶活提高了10倍，達(dá)97.52 U/mL，并將其脂肪酶基因克隆至大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化，重組菌比酶活達(dá)104 U/mL;王祎等［5］在大腸桿菌中表達(dá)了粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶，比酶活為8.6 U/mL;Ye等［6］將粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶基因克隆至畢赤酵母GS115中并成功表達(dá)，重組菌比酶活達(dá)66.2 U/mg。

粘質(zhì)沙雷氏菌所產(chǎn)的胞外脂肪酶可應(yīng)用于手性化合物的不對(duì)稱(chēng)合成［7－8］。此外，粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶對(duì)甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑有較高的耐受性［4，9］。然而，粘質(zhì)沙雷氏菌本身產(chǎn)靈菌紅素，給后期酶的分離純化造成了不便，同時(shí)粘質(zhì)沙雷氏菌潛在的致病性限制了其在手性藥物合成及生物柴油領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，將粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶基因克隆到安全宿主中進(jìn)行高效表達(dá)一直是該領(lǐng)域研究的重要方向。

前期，筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員構(gòu)建了1株重組枯草芽胞桿菌B.subtilis 168/pMA5-lipA，實(shí)現(xiàn)了來(lái)源于粘質(zhì)沙雷氏菌的脂肪酶在枯草芽胞桿菌屬的首次成功表達(dá)。該菌株為組成型表達(dá)系統(tǒng)，無(wú)需添加誘導(dǎo)劑，節(jié)約了生產(chǎn)成本，且操作更為簡(jiǎn)便，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。本文中筆者以該重組菌株為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，使其脂肪酶產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高。

1 材料與方法

1.1 菌株

粘質(zhì)沙雷氏菌JNS3-9由筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員篩選保藏;Bacillus subtilis/pMA5-lipA由筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員構(gòu)建保藏。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP)購(gòu)自阿法埃莎(上海)公司;其他試劑購(gòu)自國(guó)藥(上海)公司。

LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，固體加20 g/L瓊脂粉。

種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。

1.3 粗酶液的制備

將新鮮斜面上的菌種接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，按2%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床中發(fā)酵36 h，獲得的發(fā)酵液在4℃、10 000 r/min離心5 min，收集上清液即為粗酶液。

1.4 脂肪酶活力的測(cè)定

酶活力測(cè)定采用p-NPP法，參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。A液:16.5 mmol/L p-NPP的異丙醇溶液。B液:含有0.4%Triton X-100和0.1%阿拉伯樹(shù)膠的50 mmol/L Tris-HCI緩沖液(pH 8.0)。測(cè)定時(shí)，將相應(yīng)的A液與B液以1∶9(體積比)比例混合，取100 μL的粗酶液加入 900 μL上述混合液中，于40℃反應(yīng)10 min。立即加1 mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，于410 nm下測(cè)定光吸收值。

酶活(U)單位定義:每分鐘分解p-NPP產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚(黃色)所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

1.5 B.subtilis/pMA5-lipA發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.5.1 最適C源的選擇

分別以葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、β-環(huán)糊精、蔗糖及α-乳糖為C源，初始發(fā)酵培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。由于LB培養(yǎng)基中沒(méi)有嚴(yán)格意義上的C源，可將備選C源作為唯一C源直接加入，其他組分保持不變。以最高酶活時(shí)的相對(duì)酶活定義為100%，通過(guò)計(jì)算所測(cè)酶活力值與該批次最高酶活力值的百分比為相對(duì)酶活來(lái)確定最適C源。

1.5.2 有機(jī)N源對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響

在最適C源的基礎(chǔ)上，分別以酵母浸膏、牛肉浸膏、豆粕、大豆蛋白胨及玉米漿為有機(jī)N源，替換LB中的酵母膏和蛋白胨，其他組分不變。

1.5.3 無(wú)機(jī)N源對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響

在最適C源、有機(jī)N源基礎(chǔ)上分別添加尿素、NH4Cl、(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4及 NH4NO3等無(wú)機(jī)N源，其他組分不變。

1.5.4 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響

在最適C源、有機(jī)N源及無(wú)機(jī)N源的基礎(chǔ)上，分別以 KCl、NaNO3、KNO3、檸檬酸鈉、CaCl2、MgSO4、CuSO4等無(wú)機(jī)鹽替換LB培養(yǎng)基中的NaCl，其他組分保持不變。

1.5.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基成分

在以上單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分，本研究采用“四因素三水平”方案，選取最佳C源、最佳有機(jī)N源、最佳無(wú)機(jī)N源、最佳無(wú)機(jī)鹽為考察因素。

2 結(jié)果與討論

2.1 種子生長(zhǎng)曲線(xiàn)和最佳種齡的確定

種子的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖1所示。由圖1可知:菌株在5 h以后開(kāi)始進(jìn)入快速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，并在20 h前后進(jìn)入穩(wěn)定期，隨后菌體量開(kāi)始緩慢下降，進(jìn)入衰亡期。選擇對(duì)數(shù)中后期的菌種最為合適，即可以確定生長(zhǎng)13～15 h的種子為最佳種齡。

圖1 重組菌在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)ig.1 Growth curve of recombinant strain in LB medium

2.2 最適C源的選擇

C源對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響如圖2所示。由圖2可知:當(dāng)在LB培養(yǎng)基中添加可溶性淀粉、麥芽糖和環(huán)糊精時(shí)，菌體量處于較高水平。其中以可溶性淀粉為C源時(shí)，菌體量最大;而菌體在添加葡萄糖、乳糖時(shí)生長(zhǎng)不佳;添加蔗糖、乳糖較有利于菌體產(chǎn)脂肪酶，以蔗糖為C源時(shí)，脂肪酶產(chǎn)量最高并且菌體量也相對(duì)較高。綜合考慮，以蔗糖為C源最有利于脂肪酶產(chǎn)量的提高。

圖2 C源對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of various carbon sources on cell growth and lipase production

蔗糖濃度對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響如圖3所示。由圖3可知:重組芽胞桿菌的生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)量在添加不同濃度蔗糖時(shí)是不同的。在蔗糖質(zhì)量濃度為10～30 g/L時(shí)，菌體量和脂肪酶產(chǎn)量隨蔗糖濃度升高呈上升趨勢(shì)，隨后開(kāi)始下降;當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，菌體量與脂肪酶產(chǎn)量達(dá)到最高，最有利于提高重組菌脂肪酶的產(chǎn)量，在此條件下脂肪酶比酶活達(dá)50.1 U/mL。

圖3 蔗糖對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of sucrose concentration on cell growth and lipase production

2.3 有機(jī)N源對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響

有機(jī)N源對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響如圖4所示。由圖4可知:大豆蛋白胨和玉米漿為有機(jī)N源時(shí)，菌體生長(zhǎng)情況較好且脂肪酶產(chǎn)量較高;以牛肉浸膏、豆粕為有機(jī)N源時(shí)則相對(duì)較低;而當(dāng)以玉米漿為N源時(shí)，菌體量和脂肪酶產(chǎn)量最高，最有利于脂肪酶產(chǎn)量的提高。

圖4 有機(jī)N源對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of various organic nitrogen sources on cell growth and lipase production

玉米漿對(duì)菌體生長(zhǎng)及脂肪酶產(chǎn)量的影響如圖5所示。由圖5可知:隨著玉米漿濃度的升高，菌體量和脂肪酶產(chǎn)量皆呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。當(dāng)玉米漿質(zhì)量濃度達(dá)到25 g/L時(shí)，達(dá)到最大值，隨后開(kāi)始下降。所以當(dāng)以25 g/L的玉米漿為N源時(shí)，最有利于脂肪酶產(chǎn)量的提高，此時(shí)脂肪酶比酶活達(dá)61.5 U/mL。

2.4 無(wú)機(jī)N源對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響

無(wú)機(jī)N源對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響如圖6所示。由圖6可知:在添加不同無(wú)機(jī)N源的情況下，菌體量和脂肪酶產(chǎn)量差異較為明顯，除(NH4)2HPO4外，輔助添加其他無(wú)機(jī)N源都促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶酶活的提高。其中添加(NH4)2SO4的促進(jìn)作用最為顯著，所以當(dāng)以(NH4)2SO4為無(wú)機(jī)N源時(shí)，最有利于脂肪酶產(chǎn)量的提高。

圖5 玉米漿對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of corn syrup concentration on cell growth and lipase production

圖6 無(wú)機(jī)N源對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of inorganic nitrogen on cell growth and lipase production

圖7 (NH4)2SO4對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of(NH4)2SO4concentration on cell growth and lipase production

(NH4)2SO4濃度對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響如圖7所示。由圖7可知:低濃度時(shí)菌體量和脂肪酶產(chǎn)量隨(NH4)2SO4濃度升高而升高，高濃度的(NH4)2SO4不利于菌體量和脂肪酶產(chǎn)量的提升，當(dāng)以1.5 g/L的(NH4)2SO4為無(wú)機(jī)N源時(shí)，最有利于脂肪酶產(chǎn)量的提高，此時(shí)脂肪酶比酶活達(dá)73.2 U/mL。

2.5 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響

無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響如圖8所示。由圖8可知:當(dāng)以CaCl2為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，比初始的NaCl提升約10%;而當(dāng)以KCl為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，脂肪酶產(chǎn)量相比添加NaCl時(shí)降低了約10%，所以CaCl2最有利于脂肪酶產(chǎn)量的提高。

圖8 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of various inorganic salts on cell growth and lipase production

CaCl2濃度對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響如圖9所示。由圖9可知:菌體量和脂肪酶產(chǎn)量均隨CaCl2濃度的增大而增大;當(dāng)CaCl2質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)，最有利于脂肪酶產(chǎn)量的提高;當(dāng)CaCl2質(zhì)量濃度大于4 g/L時(shí)，菌體量和酶活反而下降。在CaCl2質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)，脂肪酶比酶活達(dá)80.1 U/mL。

圖9 CaCl2質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)量的影響Fig.9 Effects of CaCl2concentration on cell growth and lipase production

2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基成分

在上述單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分，采用“四因素三水平”方案，選取蔗糖、玉米漿、(NH4)2SO4、CaCl2為考察因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Design of orthogonal experiment

正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析如表2和表3所示。極差值的大小表明該因素水平的改變對(duì)結(jié)果的影響大小，極差值越大，該因素對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響越大。由表3極差值大小，各因素對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響從大到小依次為:玉米漿、(NH4)2SO4、蔗糖、CaCl2。為了獲得最高的產(chǎn)量，應(yīng)選擇的最優(yōu)組合是A3B3C1D2，即蔗糖 35 g/L，玉米漿 27.5 g/L，(NH4)2SO41.25 g/L，CaCl24 g/L。采用此最優(yōu)組合的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，然后測(cè)脂肪酶酶活，最終比酶活達(dá)94.7 U/mL。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiment results

2.7 初始pH對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響

分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始 pH為5.0、6.0、7.0和8.0，考察初始pH對(duì)菌體量及脂肪酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖10所示。由圖10可以看出，不同初始pH對(duì)菌體量及脂肪酶的影響顯著。pH為5.0時(shí)，菌體生長(zhǎng)受到抑制，同時(shí)脂肪酶產(chǎn)量較低;pH為6.0～7.0時(shí)，菌體量及脂肪酶產(chǎn)量較高，其中pH為7.0時(shí)為最佳。

圖10 初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)量的影響Fig.10 Effects of initial pH on cell growth and lipase production

2.8 最佳接種量的選擇

分別按1%、2%、3%、4%、5%和6%的接種量進(jìn)行接種，培養(yǎng)36 h后測(cè)定生物量和脂肪酶產(chǎn)量，所得結(jié)果如圖11所示。由圖11可以看出，隨著接種量的增加生物量和脂肪酶產(chǎn)量均有所增加，接種量為4%時(shí)達(dá)到最大值，隨后生物量和脂肪酶產(chǎn)量隨著接種量的增加逐步下降，因此可以確定4%的接種量最有利于提高生物量和脂肪酶產(chǎn)量。

圖11 接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)量的影響Fig.11 Effects of inoculating concentrations on cell growth and lipase production

2.9 重組菌在最優(yōu)發(fā)酵條件下的發(fā)酵曲線(xiàn)

在以上優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上對(duì)B.subtilis 168/pMA5-lipA進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并在不同時(shí)間段取樣測(cè)定菌體量及脂肪酶產(chǎn)量，所得結(jié)果如圖12所示。

圖12 B.subtilis 168/pMA5-lipA在最優(yōu)培養(yǎng)條件下的發(fā)酵結(jié)果Fig.12 Fermentation results of B.subtilis 168/pMA5-lipA in optimal culture conditions

由圖12可知:前期隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌體量呈不斷上升趨勢(shì)，并在33 h時(shí)達(dá)到最高值，在隨后的一段平衡期開(kāi)始緩慢下降;脂肪酶酶活的變化趨勢(shì)與之相似，在33 h時(shí)達(dá)到最大值，約98.6 U/mL，約是優(yōu)化前重組菌比酶活(33.24 U/mL)的3倍，優(yōu)化后菌體OD600達(dá)14.3，約是優(yōu)化前6.2的2.3倍，單位菌體量酶活約是優(yōu)化前的1.3倍?？梢?jiàn)優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基顯著提升了B.subtilis 168/pMA5-lipA的產(chǎn)脂肪酶能力。重組菌在30～35 h酶活較高，且較為穩(wěn)定，相對(duì)于其他菌株脂肪酶發(fā)酵過(guò)程中常出現(xiàn)較高的峰值，隨后急劇下降，重組菌具有較好的穩(wěn)定產(chǎn)酶能力，更有利于工業(yè)化應(yīng)用。

3 結(jié)論

在重組枯草芽胞桿菌B.subtilis 168/pMA5-lipA基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行了一系列搖瓶水平上的發(fā)酵優(yōu)化。確定了種子培養(yǎng)13～15 h為最佳種齡，最佳接種量為4%;通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳種齡，C源、有機(jī)N源、無(wú)機(jī)N源、無(wú)機(jī)鹽離子的種類(lèi)及濃度，最優(yōu)培養(yǎng)基成分為蔗糖 30 g/L、玉米漿 25 g/L、(NH4)2SO41.5 g/L和CaCl24 g/L;通過(guò)“四因素三水平”正交試驗(yàn)，得出最優(yōu)培養(yǎng)基為蔗糖35 g/L，玉米漿27.5 g/L，(NH4)2SO41.25 g/L，CaCl24 g/L;最后確定了最佳初始pH為7.0。用此最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)B.subtilis 168/pMA5-lipA，其脂肪酶產(chǎn)量可達(dá)98.6 U/mL發(fā)酵液，約是其優(yōu)化前產(chǎn)量33.24 U/mL的3倍，為粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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