黃金妹，鐘賽鳳，呂剛，蘆亞君

（海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南?？?571199）

·論著·

曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立和實驗觀察

黃金妹，鐘賽鳳，呂剛，蘆亞君

（海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南?？?571199）

目的探討曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴穩(wěn)定的體外培養(yǎng)介質。方法從野生黑斑蛙體內獲取裂頭蚴蟲體，置于生理鹽水、牛肉湯培養(yǎng)液及PRMI 1640培養(yǎng)并觀察蟲體存活情況。結果在三種不同的培養(yǎng)液中，裂頭蚴在生理鹽水中存活時間最短，在PRMI 1640中存活時間最長，且蟲體活動力也顯著高于生理鹽水和牛肉湯培養(yǎng)液(P＜0.05)。結論PRMI 1640是曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴在這三種不同培養(yǎng)液中最穩(wěn)定的體外培養(yǎng)介質。

曼氏迭宮絳蟲；裂頭蚴；體外培養(yǎng)

曼氏迭宮裂頭蚴是曼氏迭宮絳蟲(Sparganum mansoni)的中絳期幼蟲，在人體內寄生引起裂頭蚴病[1]。裂頭蚴可侵襲人多種組織和器官，如眼、皮下組織、腹壁、腦、脊髓、肺、乳腺等[2-3]。人感染裂頭蚴主要通過三種方式：用蛙肉、蛇肉敷貼傷口或局部紅腫患處，裂頭蚴從傷口、皮膚和黏膜侵入人體，這是主要感染方式；生食或半生食蛙肉、蛇肉和豬肉等，裂頭蚴可穿過腸壁，移行至人體其他器官組織中；飲用生水或游泳時誤食劍水蚤，劍水蚤進入人體后，原尾蚴從劍水蚤體內逸出，穿過腸壁進入腹腔、內臟組織或遷移至肌肉皮下組織，發(fā)育為裂頭蚴。裂頭蚴能破壞組織和導致失明或癱瘓，甚至死亡[4-5]。

裂頭蚴病是一種嚴重威脅人類健康的疾病[6-7]，呈世界性分布，流行于全球48個國家。文獻報道多數(shù)病例出現(xiàn)在中國、韓國、日本等地區(qū)[8-9]，其中中國有1 000多例裂頭蚴病分布在27個省、市和自治區(qū)[10-11]。

目前，裂頭蚴病的治療方案主要以手術方式摘除蟲體，保守治療裂頭蚴病尚無有效方案。因此，本文擬探討曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴穩(wěn)定的體外培養(yǎng)介質，旨在進一步了解裂頭蚴的生理特點，為保守治療裂頭蚴病提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴2013年4月于?？谑行阌^(qū)郊區(qū)采集野生青蛙，處死、剝皮、解剖，仔細觀察蛙肉，肉內見白色點狀物疑為蟲體一端，用鑷子輕拉，勿斷，顯微鏡觀察鑒定蟲種。選取蟲體完整、體長4～13 cm、伸縮活動劇烈的裂頭蚴作為實驗對象。

1.2 培養(yǎng)液配制

1.2.1 牛肉湯培養(yǎng)液50%牛肉湯，0.5%血清、0.5%葡萄糖和適當?shù)牧指袷弦夯煊陔p蒸水中，4℃保存?zhèn)溆?，使用前加? 000 U/ml青霉素。

1.2.2 PRMI 1640培養(yǎng)液PRMI 1640粉劑溶于雙蒸水中，4℃保存?zhèn)溆?，使用前加?00 U/ml青霉素和鏈霉素[12]。

1.3 體外培養(yǎng)將檢獲的裂頭蚴置于生理鹽水、牛肉湯和PRMI 1640培養(yǎng)液中，于37℃的溫箱中培養(yǎng)，每12 h換液。

1.4 觀察鏡下觀察蟲體數(shù)目、頭節(jié)及活動情況。判斷蟲體活動情況標準：Ⅰ級(每秒都有伸縮運動）；Ⅱ級(每5 s一次伸縮運動)；Ⅲ級(每10 s一次伸縮運動)；Ⅳ級(10 s以上進行一次伸縮運動)。

1.5 統(tǒng)計學方法應用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行描述性分析和方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 裂頭蚴存活時間裂頭蚴在生理鹽水中存活時間最短，為46 h，在牛肉湯培養(yǎng)液中存活63 h，在PRMI 1640培養(yǎng)液中存活時間最長，為493 h。PRMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)的裂頭蚴存活時間明顯長于其他兩種培養(yǎng)液(F=13.836，P＜0.05)。

2.2 裂頭蚴蟲數(shù)在生理鹽水和牛肉湯培養(yǎng)液中裂頭蚴的數(shù)量逐漸減少，在PRMI 1640培養(yǎng)液中的裂頭蚴先增加后減少(圖1)。

圖1 裂頭蚴在不同培養(yǎng)液中的蟲體數(shù)量

2.3 裂頭蚴活動力裂頭蚴蟲體活動力在三種不同培養(yǎng)液中減弱時間不同，在生理鹽水、牛肉湯培養(yǎng)液、PRMI 1640培養(yǎng)液中蟲體活動力開始減弱時間分別是40 h、16 h及16 h(圖2)。

圖2 裂頭蚴在不同培養(yǎng)液中的活動力

2.4 生長特性觀察裂頭蚴在生理鹽水和牛肉湯培養(yǎng)液中的生長情況，蟲體有斷裂現(xiàn)象。而在PRMI 1640中，裂頭蚴既有斷裂也有增殖的現(xiàn)象。

3 討論

體外培養(yǎng)系統(tǒng)是觀察生物現(xiàn)象和生長轉歸的基本模式[13]，能夠用于探索裂頭蚴的生長特性及其與宿主之間的關系[14]。體外培養(yǎng)時需定期更換新鮮培養(yǎng)液以便滿足蟲體生長所需的營養(yǎng)要素及排除代謝產(chǎn)物。

曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴呈長帶狀，乳白色，大小為30～360 mm×0.7 mm，體表有橫紋，不分節(jié)。本文主要探討裂頭蚴穩(wěn)定的體外培養(yǎng)介質，了解裂頭蚴在體外培養(yǎng)中的生長特性。研究顯示，裂頭蚴在生理鹽水和牛肉湯培養(yǎng)液存活時間較短，且蟲體易斷裂，活動力逐漸減弱直至死亡。牛肉湯培養(yǎng)液制備復雜，生理鹽水簡單易取，所以生理鹽水可以作為短期保存裂頭蚴的介質。三種培養(yǎng)介質比較，裂頭蚴在PRMI 1640培養(yǎng)液中存活時間最長，故PRMI 1640是裂頭蚴最穩(wěn)定的體外培養(yǎng)介質，可用來作為基本實驗模型，如抗裂頭蚴的藥物篩選、可溶性蛋白提取等。

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Reconstruction of cultivation system of Sparganum mansoni in vitro.

HUANG Jin-mei,ZHONG Sai-feng,LV Gang, LU Ya-jun.
Department of Pathogen Biology,Hainan Medical College,Haikou 571199,Hainan,CHINA

>ObjectiveTo build the system of Sparganum mansoni in vitro in order to provide experimental basis for research on Sparganum mansoni.MethodsThe Sparganum mansoni which was obtained from wild frogs was cultured in physiological saline,beef soup culture and PRMI 1640 medium.Activity and numbers of the parasite were observed by anatomical lens.ResultsFrom the survival situation of Sparganum mansoni in three different kinds of culture medium,the survival time in physiological saline was shortest,and the time in PRMI 1640 medium was longest(P＜0.05).The activity and survival time was obviously higher than physiological saline and beef soup culture(P＜0.05).The living worm was found propagation and fracture in PRMI 1640 medium.ConclusionPRMI 1640 medium is most suitable to build the system of Sparganum mansoni in vitro,with the relatively stable culture system.

Sparganum mansoni;Plerocercoid;Culture;In vitro

R383.3+5

A

1003—6350（2014）12—1723—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.12.0671

2013-12-27)

國家級創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號：201211810057）

蘆亞君。E-mail：luyajuncc@163.com