鄭燕珊，倪仰鵬，陳理明，陸 軍，程 訸，徐 涵，牛永東，5

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 汕頭 515041；

2.揭陽市人民醫(yī)院病理科，廣東 汕頭 522000；

3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，廣東 汕頭 515041；

4.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 汕頭 515041；

5.上海市腫瘤研究所“癌基因及相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”，上海 200032)

·論 著·

核受體LXRα在HBV陽性肝硬化及原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)及意義

鄭燕珊1，倪仰鵬2，陳理明3，陸 軍4，程 訸1，徐 涵1，牛永東1，5

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 汕頭 515041；

2.揭陽市人民醫(yī)院病理科，廣東 汕頭 522000；

3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，廣東 汕頭 515041；

4.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 汕頭 515041；

5.上海市腫瘤研究所“癌基因及相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”，上海 200032)

目的 檢測肝臟X受體(Liver X receptor alpha，LXRα)在HBV陽性肝硬化組織及原發(fā)性肝癌中的表達(dá)情況及臨床意義。方法收集20例揭陽市人民醫(yī)院及汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的HBV陽性肝硬化原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化染色檢測LXRα表達(dá)。Huh7細(xì)胞中分別過表達(dá)小鼠mLXRα，及共過表達(dá)HBx(HBV X protein)和mLXRα，并檢測mLXRα及HBx對內(nèi)源性LXRα信號通路下游靶基因SREBP-1 (Sterol regulatory element-binding protein 1)的影響；雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測人肝癌Huh7細(xì)胞中HBx對LXRα轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果LXRα在肝硬化組織中陽性表達(dá)率為95%，高于癌組織的25%。HBx上調(diào)SREBP-1的表達(dá)可能與HBx調(diào)控LXRα的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。結(jié)論HBx通過調(diào)節(jié)癌前高表達(dá)的LXRα的轉(zhuǎn)錄活性，并影響其信號通路可能與HCC發(fā)生相關(guān)。

LXRα；HBx；原發(fā)性肝細(xì)胞癌

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我國及世界范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其確切的發(fā)病機(jī)制迄今尚不清楚[1-3]。病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染是我國HCC發(fā)生的首要危險因素[4-7]，其中HBx(HBV X protein)被認(rèn)為是HBV感染者從慢性乙型肝炎到肝硬化，甚至HCC的整個漸變過程中的一個重要因子[5，8]。由于大多數(shù)HBV感染相關(guān)HCC患者都有脂代謝紊亂、肝硬化基礎(chǔ)。肝內(nèi)高表達(dá)的肝X受體LXR α(Liver X receptor alpha，NR1H3)在膽固醇代謝平衡、脂肪合成中發(fā)揮著非常重要的調(diào)節(jié)作用。作為一經(jīng)典的核受體，其功能發(fā)揮常需要輔因子(Co-factor)的協(xié)助來完成。HBx作為一功能廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，與LXRα相互作用后參與HBV感染相關(guān)肝硬化、HCC發(fā)生的分子機(jī)制不清楚。

本研究通過觀察LXRα在肝硬化組織及對應(yīng)的HCC組織中的表達(dá)；瞬時過表達(dá)小鼠mLXRα或/和HBx后觀察脂質(zhì)代謝相關(guān)基因SREBP-1的改變及相關(guān)機(jī)制分析，探討相關(guān)HBV陽性肝硬化及原發(fā)性肝癌發(fā)生中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 HCC組織標(biāo)本、細(xì)胞系 20例HBV陽性肝硬化組織及原發(fā)性肝癌組織HCC的組織標(biāo)本來自揭陽市人民醫(yī)院及汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的手術(shù)切除肝癌組織。所有病例均為術(shù)前未接受任何放化療的手術(shù)病例。肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.2 質(zhì)粒、報告基因系統(tǒng)、轉(zhuǎn)染 pcDNA空載體，pCDNA-Flag-HBx(AF100309.1)，pCMX-mLXRα，tk-LXRE-Luc，pCMXβ-gal及Luciferase assay系統(tǒng)及轉(zhuǎn)染方法參見我們的前期工作[9-10]。主要步驟如下：第1天，48孔板接種1×106個細(xì)胞；第2天，Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染。每孔轉(zhuǎn)0.6 μg DNA，3復(fù)孔；第3天，10 μM的GW3965處理(高糖MEM培養(yǎng)基含10%活性炭吸附處理的FBS)16～24 h，luciferase檢測(Vicor2 1420 multilabel counter)。LXR α激動劑GW3965購自Sigma。mLXRα或mLXRα和pCDNA-Flag-HBx共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞。Huh7細(xì)胞在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度37?C，濕度95%，CO2濃度5%。細(xì)胞長成單層后，37?C，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化細(xì)胞，取4×105個細(xì)胞接種6孔板。待細(xì)胞滿度達(dá)70%時，參照Invitrogen公司的Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑說明轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞。隔天GW3965處理16～24 h，常規(guī)收集細(xì)胞及處理。

1.3 Real-time PCR 參照Invitrogen公司的TRIzol試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA，Reverse Transcription System Kit(Promega)逆轉(zhuǎn)錄cDNA。以hCyclophilin為內(nèi)參，Real-time PCR檢測LXRα與SREBP-1的水平。hCyclophilin上游引物：5'-TGGTGTTTGGCAAAGTGAAA-3'，下游引物：5'-TCGAGTTGTCCACAGTCAGC-3'；SREBP-1上游引物：5'-TGACTTCCCTGGCCTATTTG-3'，下游引物：5'-TTCAATGGAGTGGGTGCAG-3'；LXR α上游引物:5'-CCCTTCAGAACCCACAGAGATC-3'，下游引物:5'-GCTCCTTCCCCAGCATTTT-3’。

1.4 免疫組化 手術(shù)標(biāo)本均用10%的中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋及切片。免疫組織化學(xué)染色采用SABC法。鼠抗人LXRα(PP-K8607-00)抗體購自R&D，二抗購自購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照。雙盲法觀察切片，選取至少3個代表性視野，并根據(jù)顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率綜合判斷結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，Real-time PCR實(shí)驗(yàn)和Luciferase assay報告基因結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s)表示；組間差異比較用Excel的Student's-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LXRα在HBV陽性肝硬化組織及HCC中的表達(dá) HBV陽性肝硬化組織中LXRα陽性表達(dá)率為95%(19/20)，明顯高于癌組織的表達(dá)率[25%(5/20)]。LXRα高表達(dá)的肝硬化組織中，其細(xì)胞定位除肝細(xì)胞的胞漿外，同時胞核內(nèi)也可觀察到LXRα的表達(dá)(圖1A)；而弱表達(dá)的癌組織中，LXRα主要定位于肝細(xì)胞的胞漿(圖1B)；陰性對照(圖1C)中則未見棕黃色顆粒。

2.2 HBx與LXRα下游靶基因SREBP-1的關(guān)系 為研究異常表達(dá)的LXRα或LXRα信號通路參與了HBV感染相關(guān)的肝硬化或HCC的發(fā)生，我們在Huh7細(xì)胞中瞬時過表達(dá)mLXRα和/或HBx，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBx可以上調(diào)LXRα下游靶基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白SREBP-1的表達(dá)，尤其是在LXRα激動劑GW3965存在條件下。由于SREBP-1的功能主要與固醇代謝及甘油三酯合成有關(guān)，因此，我們推測LXR α信號通路的異常可能參與了HBV感染相關(guān)的肝硬化或HCC的脂代謝調(diào)控，見圖2。

2.3 HBx與LXRα轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)系 為進(jìn)一步研究LXRα信號通路與HBV感染相關(guān)疾病發(fā)生的可能機(jī)制，我們用LXRα的Luciferase assay報告基因系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，和pcDNA空載體相比，過表達(dá)的HBx可以上調(diào)內(nèi)源性LXRα的轉(zhuǎn)錄活性；當(dāng)我們共過表達(dá)小鼠mLXRα和HBx時，HBx對LXRα的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)尤其明顯，并且多呈配體依賴模式，見圖3。

圖1 LXRα免疫組化染色結(jié)果

圖2 過表達(dá)HBx與LXRα下游靶基因SREBP-1的關(guān)系

圖3 HBx與LXRα轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控(*P＜0.05，**P＜0.01)

3 討論

肝細(xì)胞性肝癌由于其起病隱匿，病情發(fā)展快，轉(zhuǎn)移早，確診時多屬中、晚期，臨床治療及預(yù)后效果較差。因此，探討肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制仍為目前肝癌研究領(lǐng)域所關(guān)注的重點(diǎn)。

HBx是HBV基因組里四個開放讀碼框中最小的一個，編碼一個154 aa的小分子蛋白質(zhì)。由于HBx本身不是原癌基因的產(chǎn)物，只是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控多個HCC相關(guān)信號通路的輔因子(Co-factor)。因此，HBx被認(rèn)為是HBV感染相關(guān)HCC的重要影響因素[4-7]。鑒于核或胞漿分布的HBx空間定位與核受體的轉(zhuǎn)錄激活相一致[11]；盡管已有韓國科學(xué)人員研究發(fā)現(xiàn)，HBx誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂代謝通路紊亂及肝纖維化可能與LXR或PPAR(Peroxisome proliferator-activated receptor)核受體信號通路[12-14]、TNF-α通路及肝細(xì)胞凋亡[15]有關(guān)。但由于HBV的DNA聚合酶不具有校讀功能，使得包括HBx在內(nèi)的HBV病毒蛋白存在多種型別和地域分布的不同；再加上不同種系的HBx轉(zhuǎn)基因小鼠中有的可以觀察到HCC發(fā)生[7-8]，有的則不可以觀察到HCC發(fā)生[5]。因此，我們選擇國內(nèi)南方多流行的HBV B基因型及血清型Adw2作為我們的研究對象，不同于已有的韓國人的HBV C基因型及相應(yīng)的血清型。

基于大多數(shù)HBV陽性原發(fā)性肝癌患者多存在嚴(yán)重的脂肪肝、肝硬化及纖維化，及大量的研究證明作為核受體超家族成員之一的LXRα及其下游基因SREBP-1信號通路與肝內(nèi)甘油三酯、膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)平衡及紊亂密切相關(guān)等實(shí)際情況。我們首先對LXRα在HBV感染相關(guān)的肝硬化及HCC中的表達(dá)情況做了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LXRα在肝硬化組織中的表達(dá)明顯高于相對應(yīng)的HCC組織。提示我們，LXRα或LXRα信號通路可能在HBV感染陽性HCC發(fā)生的早期，即脂肪肝、肝硬化及纖維化階段發(fā)揮作用。隨后，過表達(dá)HBx和/或mLXRα的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBx可以上調(diào)LXRα信號通路下游SREBP-1的表達(dá)；機(jī)制分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)可能與HBx調(diào)控LXRα的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。

鑒于“HBV感染-肝炎-慢性乙肝-肝硬化-HCC”發(fā)生發(fā)展的多階段、多步驟、多因素參與的復(fù)雜性，以及HBV病毒蛋白差異、LXRα、抑或HBx與LXRα間相互作用均存在作用范圍廣泛、機(jī)制復(fù)雜等因素，我們認(rèn)為，“HBx-LXRα-SREBP-1”可能參與了國內(nèi)HBV感染陽性HCC的早期發(fā)生，盡管上述機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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Expression and clinical significance of LXRα in HBV infection-associated liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma

ZHENG Yan-shan1,NI Yang-peng2,CHEN Li-ming3,LU Jun4,CHENG He1,XU Han1,NIU Yong-dong1,5
1.Department of Pharmacology,Medical College of Shantou University,Shantou 515041,Guangdong,CHINA;2. Department of Pathology,the People's Hospital of Jieyang,Shantou 522000,Guangdong,CHINA;3.Department of Oncology,the First Affiliated Hospital of Medical College,Shantou University,Shantou 515041,Guangdong,CHINA;4. Department of Hepatobilary Surgery,the First Affiliated Hospital of Medical College,Shantou University,Shantou 515041, Guangdong,CHINA;5.National Key Lab of Oncogene and Related Gene,Shanghai Cancer Institute,Shanghai 200032, CHINA

ObjectiveTo detect the expression of liver X receptor alpha(LXRα)in HBV infection associated liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma tissues and explore its clinical significance.MethodsThe expression of LXRα in 20 cases of HBV infection-associated liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma specimens from Jieyang People's Hospital and the First Affiliated Hospital of Medical College,Shantou University was detected by immunohistochemical staining.Endogenous SREBP-1,a typical LXRα target gene,was detected by real-time PCR after over-expressing mice mLXRα,HBx and mLXRα in Huh7 cells.The transcriptional regulation of LXRα signaling by HBx was evaluated by dual luciferase reporter system.ResultsThe positive expression rate of LXRα was 95%in cirrhosis,which was higher than that in HCC tissue with only 25%.The up-regulation of SREBP-1 expression by HBx may be related with the transcriptional activation of LXRα by HBx.ConclusionHBx maybe associated with the development of HCC by regulation of the transcriptional activation of LXRa,which was higher in cirrhosis,and activating the signal pathway

Liver X receptor alpha;Hepatitis B virus X protein;Hepatocellular carcinoma

R735.7

A

1003—6350(2014)15—2185—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.15.0851

2014-03-18)

中國博士后科學(xué)基金(編號：2012M510200)；廣東省自然科學(xué)基金(編號：S2012010010955)；上海市腫瘤研究所“癌基因及相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”開放課題(編號：90-14-03)；中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專項(xiàng)資金

牛永東。E-mail:ydniu@126.com