魏開鵬，潘興南，魏梅娟，張小曼，許正鋸

（中國人民解放軍第180醫(yī)院肝病中心，福建 泉州 362000）

異基因人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與外周血單個(gè)核細(xì)胞體外共培養(yǎng)的相互影響

魏開鵬，潘興南，魏梅娟，張小曼，許正鋸

（中國人民解放軍第180醫(yī)院肝病中心，福建 泉州 362000）

目的探討異基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)與外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）在體外共培養(yǎng)的相互影響。方法將異基因成人來源的BMSC與PBMC在體外分別按1：10混合共培養(yǎng)，采用氚胸腺嘧啶核甙摻入方法檢測(cè)PHA刺激PBMC增殖的活性，采用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)液中分泌的IL-6、IL-8和PGE2水平。結(jié)果BMSC與PBMC共培養(yǎng)組的PBMC增殖率明顯減少(P＜0.01)，抑制率均超過50%。加入PBMC共培養(yǎng)后，BMSC分泌IL-6、IL-8和PGE2顯著增加(P＜0.01)。結(jié)論BMSC可以抑制PHA刺激引起的PBMC增殖，PBMC可以促進(jìn)BMSC分泌免疫活性因子，BMSC可能具有雙向的免疫調(diào)控作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；外周血單個(gè)核細(xì)胞；共培養(yǎng)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)是一群骨髓來源的具有自我更新和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞[1]。BMSC由于獲取方便、容易擴(kuò)增以及良好的倫理適應(yīng)性而在細(xì)胞移植治療方面?zhèn)涫荜P(guān)注[2]。后來發(fā)現(xiàn)除了具備干細(xì)胞的基本屬性，BMSC還具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用[3]。動(dòng)物研究和臨床試驗(yàn)顯示，BMSC輸注可以延長(zhǎng)異基因移植物的存活時(shí)間，移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率顯著降低[4]。本研究通過探討B(tài)MSC與外周血單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell，PBMC)在體外共培養(yǎng)的相互影響，為認(rèn)知BMSC的免疫學(xué)作用提供體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料BMSC來源于3個(gè)健康成人志愿者的骨髓，PBMC來源于另外1個(gè)健康成人的外周靜脈血，這些供者之間沒有同源關(guān)系，與供者均簽署《知情同意書》。LG-DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)試劑盒、軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)試劑盒和脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)試劑盒均購自美國Life公司。Ficoll分離液購自美國GE公司。FITC標(biāo)記的抗人CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105及抗鼠IgG1-κ單抗均購自美國Biolegend公司。檢測(cè)IL-6、IL-8和PGE2的ELISA試劑盒購自美國R&D System公司。

1.2 BMSC的分離和鑒定按照本課題組之前所報(bào)道的方法[5]，從成人骨髓分離BMSC，并從形態(tài)、表型和誘導(dǎo)分化三個(gè)方面進(jìn)行綜合鑒定。將收獲的第3代BMSC分裝凍存到液氮備用。

1.3 PBMC的分離采集人外周靜脈血等量稀釋后沿離心管壁緩慢加到Ficoll分離液上面，注意不要破壞界面，250 g離心30 min后吸棄上層液體，收獲白膜狀的細(xì)胞層即PBMC。將PBMC分裝凍存到液氮備用。

1.4 PHA刺激PBMC增殖試驗(yàn)BMSC按2× 104個(gè)/ml密度接種入96孔板，每孔100μl設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)2 h貼壁后加入異基因的PBMC(2×105個(gè)/ml，100μl)，并添加PHA(2.5μg/ml)。BMSC與PBMC按1:10混合進(jìn)行共培養(yǎng)，設(shè)置未添加PHA的孔作為對(duì)照。在孵箱中持續(xù)培養(yǎng)72 h，結(jié)束前4 h添加氚胸腺嘧啶核甙(3H-TdR)。培養(yǎng)結(jié)束收獲細(xì)胞用液閃計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，以每分鐘液閃計(jì)數(shù)(CPM)表示增殖活性。

1.5 ELISA檢測(cè)分泌細(xì)胞因子將異基因的BMSC和PBMC按1:10混合共培養(yǎng)24 h(如上所述)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA方法檢測(cè)IL-6、IL-8和PGE2的水平。操作按試劑盒說明書進(jìn)行，分別檢測(cè)單獨(dú)培養(yǎng)的BMSC、PBMC作為對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSC的鑒定我們分離到的BMSC具有以下幾個(gè)特征：(1)黏附塑料培養(yǎng)瓶底面生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭狀的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)并行排列(圖1A-a，b，c)；(2)高表達(dá)CD73、CD90和CD105，低表達(dá)或不表達(dá)CD14、CD34和CD45等表面分子(圖1B)；(3)在特定條件下培養(yǎng)21 d后，它們可被誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞(圖1A-d，e，f)。以上特征符合國際干細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(ISCT)提出的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[6]。

圖1 BMSC的鑒定

2.2 BMSC對(duì)PHA刺激PBMC增殖的影響我們將異基因的3個(gè)成人的BMSC和另外1個(gè)成人的PBMC在體外分別進(jìn)行共培養(yǎng)，并添加PHA進(jìn)行刺激。我們發(fā)現(xiàn)BMSC與PBMC共培養(yǎng)的組中，PHA刺激引起的PBMC增殖明顯減少(P＜0.01)，各組加入BMSC共培養(yǎng)后的增殖抑制率均超過50%(表1)。以上說明，BMSC對(duì)PHA刺激引起的PBMC增殖具有明顯抑制作用。

表1 各組PHA刺激PBMC增殖活性的比較(±s)

表1 各組PHA刺激PBMC增殖活性的比較(±s)

注：3個(gè)組的BMSC分別來自3個(gè)異基因供者，PBMC來自另外1個(gè)異基因供者；用每分鐘液閃計(jì)數(shù)(CPM)表示增殖活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；單獨(dú)PBMC或BMSC培養(yǎng)組的CPM均小于1 000。

組別1 2 3 PBMC+PHA 28057±2903 28057±2903 28057±2903 PBMC+PHA+BMSC 11263±2205 13725±2737 10924±2066抑制率(%) 59.86 51.08 61.06 t值7.98 6.22 8.33 P值＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 PBMC對(duì)BMSC分泌細(xì)胞因子的影響我們?cè)隗w外培養(yǎng)過程中檢測(cè)可溶性細(xì)胞因子的分泌量，BMSC單獨(dú)培養(yǎng)可以分泌IL-6、IL-8和PGE2等免疫活性細(xì)胞因子，PBMC單獨(dú)培養(yǎng)可以檢測(cè)到少量IL-6和IL-8。當(dāng)我們將異基因的BMSC與PBMC按1：10比例進(jìn)行共培養(yǎng)后，IL-6、IL-8和PGE2的分泌量均顯著增加(P＜0.01)，其中PGE2的分泌量增加幅度最大(圖2)。

圖2 PBMC對(duì)BMSC分泌細(xì)胞因子的影響

3 討論

BMSC作為比較原始的基質(zhì)細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等參與構(gòu)成造血微環(huán)境，其表型和功能與胸腺基質(zhì)細(xì)胞相似提示BMSC可能在免疫調(diào)節(jié)方面有一定的作用[7]。BMSC不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子和FasL，也不表達(dá)CD80、CD86和CD40等共刺激分子[8]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將BMSC與異基因外周血PBMC或同種異體T細(xì)胞共培養(yǎng)并不引起T細(xì)胞的活化增殖[9]。PHA作為一種有絲分裂原可以強(qiáng)烈刺激T細(xì)胞活化增殖，但本研究發(fā)現(xiàn)添加BMSC共培養(yǎng)后PHA刺激引起的PBMC增殖受到明顯的抑制，說明BMSC除了具有較低的免疫原性和抗原提呈能力，還可以發(fā)揮免疫抑制作用。

BMSC具有基質(zhì)細(xì)胞的特性，能夠分泌多種可溶性細(xì)胞因子[10]。PGE2不僅可以抑制B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，也可以抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，在體內(nèi)作為一種重要的負(fù)向調(diào)節(jié)因子維持免疫平衡[11]。我們發(fā)現(xiàn)，BMSC體外培養(yǎng)時(shí)自身可以分泌少量的PGE2。當(dāng)與異基因的PBMC混合培養(yǎng)時(shí)，BMSC分泌的PGE2急劇增加，這提示PGE2作為一種免疫抑制因子可能在之前觀察到的免疫抑制現(xiàn)象的機(jī)制中扮演重要角色。

IL-6促進(jìn)B細(xì)胞和T細(xì)胞活化參與炎癥反應(yīng)，IL-8作為一種趨化因子對(duì)炎癥效應(yīng)細(xì)胞具有強(qiáng)烈的趨化作用[12]。我們發(fā)現(xiàn)BMSC體外培養(yǎng)時(shí)自身也可以分泌少量的IL-6和IL-8。當(dāng)與同種異體的PBMC混合培養(yǎng)時(shí)，這兩種免疫促進(jìn)因子也明顯升高，這提示BMSC不僅可以分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫抑制作用，也可以分泌細(xì)胞因子促進(jìn)免疫應(yīng)答。因此，BMSC在不同的微環(huán)境調(diào)控下可能具有雙向的免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，BMSC在體外可以抑制PHA刺激引起的PBMC增殖，PBMC可以促進(jìn)BMSC上調(diào)PGE2等免疫抑制因子的分泌，也可以促進(jìn)BMSC上調(diào)IL-6和IL-8等促炎因子的分泌。目前對(duì)BMSC與免疫系統(tǒng)的關(guān)系并不十分清楚，BMSC可能通過多種途徑與免疫細(xì)胞互動(dòng)發(fā)揮雙向免疫調(diào)控作用，其具體細(xì)節(jié)和機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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Interactions of allogeneic human bone marrow mesenchymal stem cell and peripheral blood mononuclear cell cocultured in vitro.

WEI Kai-peng,PAN Xing-nan,WEI Mei-juan,ZHANG Xiao-man,XU Zheng-ju.
Center of Liver

Disease,the 180thHospital of PLA,Quanzhou 362000,Fujian,CHINA

ObjectiveTo explore the interaction of allogeneic human bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC)and peripheral blood mononuclear cell(PBMC)cocultured in vitro.MethodsHuman BMSC and PBMC isolated from unrelated donors were cocultured(BMSC to PBMC ratio,1:10).3H-TdR incorporation test were used to evaluate PHA-induced proliferation.ELISA test was used to determine the levels of IL-6,IL-8 and PGE2 in cell culture supernatant.ResultsThe presence of BMSC resulted in a statistically significant(P＜0.01)decrease in PHA-induced proliferation in PBMC and the inhibition rate was more than 50%.The levels of IL-6,IL-8 and PGE2 significantly(P＜0.01)increased when PBMC were added to BMSC.ConclusionBMSC can mediate suppression of PHA-induced PBMC proliferation.PBMC can promote BMSC to secrete positive and negative immune factors.BMSC may have dual effects on immune reactions.

Bone marrow mesenchymal stem cell(BMSC);Peripheral blood mononuclear cell(PBMC);Coculture

R329.2+8

A

1003—6350（2014）17—2507—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.0982

2014-03-25)

泉州市社會(huì)發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2012Z60）

魏開鵬。E-mail：kpweicn@163.com