付寶龍，潘光華，朱大玲，才金玲，張寶玉

(1. 天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院海洋研究所，青島 266071)

中國擁有近 300萬平方千米海域，海岸線長達(dá)32,000千米，海洋藻類資源豐富，尤其是海洋微藻資源．這些微藻是海洋初級(jí)生產(chǎn)力，為其他海洋生物提供食物來源，維持近海生態(tài)系統(tǒng)．然而，一旦近海發(fā)生富營養(yǎng)化，某些微藻會(huì)出現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)的爆發(fā)性增長，形成赤潮，造成嚴(yán)重的生態(tài)災(zāi)難．因此，研究赤潮微藻的生物學(xué)特性、揭示其快速增殖的機(jī)制、解釋赤潮產(chǎn)生的原因是目前研究的熱點(diǎn)．如果從另外的視角來看赤潮微藻，是否可以利用赤潮微藻的快速增殖，為人類解決能源問題，則是一個(gè)值得高度關(guān)注的研究課題．

赤潮微藻主要集中在甲藻、硅藻、針胞藻和定鞭藻等門類中，其中以甲藻類和硅藻類所占的種類最多[1]．一般微藻的細(xì)胞中均含有油脂，但不同微藻的油脂含量有明顯差異，甚至同一種的不同品系也存在著很大差別，油脂含量較高的微藻主要集中于綠藻、硅藻、金藻等真核微藻中[2]．目前，微藻生物能源的研究主要集中在綠藻和硅藻上[3]，其中骨條藻屬的中肋骨條藻是一種常見的硅藻屬赤潮藻，具有很高的油脂含量(14%～51%)[4]，同時(shí)作為海產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中蝦蟹的餌料，其培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，有一定的培養(yǎng)規(guī)模；但是，以骨條藻作為生產(chǎn)生物能源的原料，關(guān)注其油脂積累過程和油脂含量提高的研究還不多見．因此，本實(shí)驗(yàn)研究了培養(yǎng)液中以不同濃度的硝酸鈉、氯化銨和尿素作為氮源對(duì)骨條藻的光合活性、生長和中性脂積累的影響，希望能夠?yàn)樯a(chǎn)生物能源的大規(guī)模培養(yǎng)提供經(jīng)驗(yàn)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)方法

骨條藻采集自天津塘沽河口水域，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室分離純化并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定．

微藻在實(shí)驗(yàn)室的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(20±1)℃，光照度為 5,000,lx，光/暗周期為12,h/12,h，每個(gè)150,mL三角瓶中培養(yǎng)100,mL藻液，所用培養(yǎng)基為人工海水配制的 f/2培養(yǎng)基[5]，單藻種靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為 8,d．實(shí)驗(yàn)采用 3種氮源分別為硝酸鈉、氯化銨和尿素，以 f/2培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)氮源濃度 8.8×10-4,mol/L 為基準(zhǔn)，按照 1/100、1/50、1/20、1/10、1/5、1/2和標(biāo)準(zhǔn)f/2設(shè)定氮源濃度由低到高依次為 8.8×10-6、1.8×10-5、4.4×10-5、8.8×10-5、1.8×10-4、4.4×10-4、8.8×10-4,mol/L．

1.2 分析方法

1.2.1 光合活性的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)使用IMAGING–PAM型調(diào)制脈沖熒光儀(德國 Heinz Walz GmbH 公司)，利用調(diào)制葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)(pulse amplitude modulation，PAM)，測(cè)量樣品的葉綠素?zé)晒鈪?shù)來反映藻細(xì)胞的光合活性[6]．具體方法為：每瓶藻液各取250,μL分別加到96孔板的3個(gè)孔內(nèi)，使用 IMAGING–PAM 型調(diào)制脈沖熒光儀測(cè)量樣品的潛在最大光合效率 Fv/Fm和實(shí)際光合效率Y(Ⅱ)．每個(gè)樣品在測(cè)定前暗適應(yīng) 15,min．設(shè)定光合有效輻射(photosynthetically active radiation，PAR)為24,μmol/(m2·s)．

1.2.2 生長測(cè)定

對(duì)處于指數(shù)生長末期的骨條藻的藻液進(jìn)行500～750,nm 的吸光度光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在 655,nm 處有1個(gè)吸光度低峰，680,nm處有1個(gè)吸光度高峰(葉綠素 a的吸收峰)．由于不同氮源濃度會(huì)對(duì)骨條藻的葉綠素a的含量產(chǎn)生影響，而 655,nm處的吸光度是整個(gè)吸收光譜的最低點(diǎn)，該點(diǎn)處光吸收值受色素含量影響最小，可以看作僅與藻體細(xì)胞密度相關(guān)，因此選擇 655,nm處的吸光度來測(cè)量骨條藻的生長．測(cè)定藻液在 655,nm 下的吸光度，藻細(xì)胞數(shù)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)得到的回歸方程 Y＝22.94×A655＋0.032,3(R2＝0.999,9)計(jì)算細(xì)胞密度 Y(106,mL–1)．

1.2.3 油脂測(cè)定

前人的研究結(jié)果[7]表明，經(jīng)尼羅紅染色后的微藻在 480,nm光激發(fā)下，位于 580,nm左右的熒光峰的相對(duì)熒光強(qiáng)度與稱質(zhì)量法測(cè)定的油脂含量呈線性正相關(guān)．因此，對(duì)處于指數(shù)生長末期的骨條藻的藻液使用 Hitachi F–4500型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)進(jìn)行 500～750,nm 掃描，確定骨條藻尼羅紅染色的熒光峰在575,nm．

對(duì)不同濃度下藻細(xì)胞在該熒光峰的相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)用稱質(zhì)量法測(cè)定各個(gè)樣品的油脂含量，可以得出該熒光峰的相對(duì)熒光強(qiáng)度與藻細(xì)胞的油脂含量的關(guān)系式．具體方法為：1,mL藻液加 0.01,mL尼羅紅染料(丙酮溶解，質(zhì)量濃度為 0.1,g/L)染色20,min后，使用 Hitachi F-4500型熒光分光光度計(jì)，以 480,nm 光激發(fā)，測(cè)定 500～750,nm 熒光發(fā)射光譜，以確定特殊熒光峰，再以該熒光峰的熒光強(qiáng)度減去藻細(xì)胞在該波長處的自身熒光強(qiáng)度和尼羅紅在該波長處的熒光強(qiáng)度，得到相對(duì)熒光強(qiáng)度．通過該熒光峰的相對(duì)熒光強(qiáng)度與藻細(xì)胞的油脂含量的關(guān)系式可得到細(xì)胞中油脂的含量．

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析.使用Origin 8.0軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差．

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的3種氮源對(duì)骨條藻光合活性的影響

圖 1—圖 6是 3種氮源對(duì)骨條藻 Fv/Fm和Y(Ⅱ)的影響．從圖中可以看出，各組的 Fv/Fm 和Y(Ⅱ)在接種后第 1天都有所升高，同時(shí)能正常生長的氮源種類相同的各組之間的差距不大，表明此時(shí)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽充足，骨條藻的光合活性正常．隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，各組的Fv/Fm和Y(Ⅱ)都出現(xiàn)了下降，氮源濃度越低下降的速度越快．在第 7天時(shí)，3種氮源都只有濃度為 4.4×10-4,mol/L和 8.8×10-4,mol/L的兩組的 Fv/Fm 和 Y(Ⅱ)能被測(cè)出，表明隨著氮源的消耗，各組的光合活性都受到了抑制．在第 6、7天，氯化銨組后兩組的 Fv/Fm 和 Y(Ⅱ)都高于硝酸鈉組和尿素組后兩組的Fv/Fm和Y(Ⅱ)．在第8天時(shí)，硝酸鈉組和尿素組后兩組的 Fv/Fm 和 Y(Ⅱ)都出現(xiàn)了上升，而氯化銨組后兩組的 Fv/Fm 和 Y(Ⅱ)則持續(xù)下降，表明硝酸鈉組和尿素組中開始有部分藻細(xì)胞死亡，釋放了一些氮源，而氯化銨組則能繼續(xù)保持生長．因此，氯化銨是比較適合骨條藻生長的氮源．

圖1 硝酸鈉對(duì)骨條藻Fv/Fm的影響Fig.1 Effect of NaNO3 on Fv/Fm of Skeletonema

圖3 氯化銨對(duì)骨條藻Fv/Fm的影響Fig.3 Effect of NH4Cl on Fv/Fm of Skeletonema

圖5 尿素對(duì)骨條藻Fv/Fm的影響Fig.5 Effect of urea on Fv/Fm of Skeletonema

圖2 硝酸鈉對(duì)骨條藻Y(Ⅱ)的影響Fig.2 Effect of NaNO3 on Y(Ⅱ)of Skeletonema

圖4 氯化銨對(duì)骨條藻Y(Ⅱ)的影響Fig.4 Effect of NH4Cl on Y(Ⅱ)of Skeletonema

圖6 尿素對(duì)骨條藻Y(Ⅱ)的影響Fig.6 Effect of urea on Y(Ⅱ)of Skeletonema

2.2 不同氮源最適合骨條藻生長的濃度確定

各組的骨條藻在第1天的生長速度最快，除了氮濃度最高的 8.8×10-4,mol/L的氯化銨和尿素外，其他各組生物量的增長都超過110%．這與藻細(xì)胞的光合活性在第1天的升高表現(xiàn)一致，表明此時(shí)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)充足，適合骨條藻的生長．而骨條藻在氮濃度為8.8×10-4,mol/L 尿素中的生長好于氮濃度為 8.8×10-4mol/L氯化銨，則表明高濃度的氯化銨對(duì)骨條藻生長的抑制比高濃度的尿素強(qiáng)．能正常生長的各組氮源濃度的最大生物量基本都出現(xiàn)在第8天，其中氯化銨組的生長是最好的，其次是尿素組，最后的是硝酸鈉組，3種氮源中生長最好的都是氮濃度為 4.4×10-4,mol/L，這與整個(gè)培養(yǎng)過程中藻細(xì)胞的光合活性的表現(xiàn)是一致的．

3種氮源的最大生物量的比較如圖7所示，硝酸鈉組和尿素組的最大生物量與氯化銨組都有極顯著差異(P＜0.01)，硝酸鈉組的最大生物量與尿素組有顯著差異(P＜0.05)．因此，可以確定最適合骨條藻生長的氮源是氯化銨，其次是尿素，最后的是硝酸鈉，3種氮源的最適氮濃度都是4.4×10-4,mol/L．

圖7 不同氮源最適合骨條藻生長的濃度下的最大生物量Fig.7 Maximum biomass of Skeletonema at the optimum concentration of different nitrogen sources for its growth

2.3 不同濃度的3種氮源對(duì)骨條藻中性脂積累的影響

2.3.1 不同濃度硝酸鈉對(duì)骨條藻中性脂積累的影響

圖 8和圖 9是培養(yǎng)過程硝酸鈉組各組的中性脂積累的過程．前 4,d各組每 106個(gè)細(xì)胞的尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，在第 5天，氮濃度較低的前5組的熒光強(qiáng)度開始出現(xiàn)增長，基本表現(xiàn)為氮源濃度越低的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)．在第 7天各組的熒光強(qiáng)度都出現(xiàn)了大幅度的增長，在第 8天即出現(xiàn)了下降．其中 1,mL藻液的尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度是藻細(xì)胞中油脂總量的指標(biāo)，而 106個(gè)細(xì)胞的尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度則是藻細(xì)胞中油脂百分含量的指標(biāo)，兩者的最高值都出現(xiàn)在第 7天起始氮濃度為 1.8×10-4,mol/L的藻液，按照 106個(gè)細(xì)胞的尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度與藻細(xì)胞的油脂含量關(guān)系式得出其油脂含量為28.46%．

圖8 硝酸鈉對(duì)骨條藻 1,mL藻液尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.8 Effect of NaNO3 on the relative fluorescence values of 1,mL Skeletonema solution stained with Nile red

圖9 硝酸鈉對(duì)骨條藻 106個(gè)細(xì)胞尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.9 Effect of NaNO3 on the relative fluorescence values of 106 algae cells of Skeletonema stained with Nile red

2.3.2 不同濃度的氯化銨對(duì)骨條藻中性脂積累的影響

圖 10和圖 11是培養(yǎng)過程氯化銨組各組的中性脂積累的過程．前 4,d各組106個(gè)細(xì)胞的尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，在第 5天，氮濃度較低的前5組的熒光強(qiáng)度同樣開始出現(xiàn)增長，熒光強(qiáng)度與氮源濃度的負(fù)相關(guān)關(guān)系比硝酸鈉組更明顯．同樣在第7天各組的熒光強(qiáng)度都出現(xiàn)了大幅度的增長，在第8天即出現(xiàn)了下降．其中 1,mL藻液和 106個(gè)細(xì)胞的尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度最高的都是起始氮濃度為8.8×10-6,mol/L的藻液第 7天的值，按照 106個(gè)細(xì)胞的尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度與藻細(xì)胞的油脂含量關(guān)系式得出其油脂含量為31.07%．

圖10 氯化銨對(duì)骨條藻 1,mL藻液尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.,10 Effect of NH4Cl on the relative fluorescence values of 1,mL Skeletonema solution stained with Nile red

圖11 氯化銨對(duì)骨條藻 106個(gè)細(xì)胞尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.,11 Effect of NH4Cl on the relative fluorescence values of 106 algae cells of Skeletonema stained with Nile red

2.3.3 不同濃度的尿素對(duì)骨條藻中性脂積累的影響

圖 12和圖 13是培養(yǎng)過程中尿素組各組的中性脂積累的過程．前 5,d各組 106個(gè)細(xì)胞的尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，在第 6天，氮濃度較低的前5組的熒光強(qiáng)度開始出現(xiàn)增長，熒光強(qiáng)度與氮源濃度同樣呈負(fù)相關(guān)關(guān)系．在第 7天各組的熒光強(qiáng)度都出現(xiàn)了大幅度的增長，在第 8天即出現(xiàn)了下降．其中1,mL藻液和106個(gè)細(xì)胞的尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度最高的都是起始氮濃度為1.8×10-5,mol/L的藻液第7天的值，按照 106個(gè)細(xì)胞的尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度與藻細(xì)胞的油脂含量關(guān)系式得出其油脂含量為27.99%．

圖12 尿素對(duì)骨條藻1,mL藻液尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.,12 Effect of urea on the relative fluorescence values of 1,mL Skeletonema solution stained with Nile red

圖13 尿素對(duì)骨條藻 106個(gè)細(xì)胞尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.,13 Effect of urea on the relative fluorescence values of 106 algae cells of Skeletonema stained with Nile red

2.3.4 綜合分析

3種氮源組中出現(xiàn)的1,mL藻液和 106個(gè)細(xì)胞尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度如圖14所示．

圖14 最適合油脂積累的氮濃度下3種氮源1,mL藻液和106個(gè)細(xì)胞尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.,14 Effect of three nitrogen sources at the optimum concentration on the relative fluorescence values of 1,mL algae solution and 106 algae cells staoned with Nile red

1,mL藻液的尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度表示油脂總量，106個(gè)細(xì)胞尼羅紅染色相對(duì)熒光強(qiáng)度可以計(jì)算出油脂的含量．可以看出，氯化銨的兩項(xiàng)值都是最高的，同時(shí)，所用的氮源量也是最低的，因此氯化銨是最適合骨條藻中性脂積累的氮源．

3 討 論

氮是浮游植物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、磷脂和葉綠素等的基本元素，在浮游植物生命活動(dòng)中占有重要的地位．海水中的無機(jī)氮主要包括-N和-N，它們是能被海洋浮游植物直接利用的氮源，而尿素在有機(jī)氮源中是研究比較廣泛的一種[8–9]．通常認(rèn)為浮游植物最先吸收-N，與細(xì)胞內(nèi)碳水化合物衍生的酮酸通過轉(zhuǎn)氨基作用直接合成氨基酸；而-N和-N則必須經(jīng)過相應(yīng)的硝酸還原酶和亞硝酸還原酶還原成-N[10]．在大多數(shù)情況下，甚至當(dāng)氧化態(tài)氮源(如-N 和-N)更充足的時(shí)候，浮游植物更傾向于利用還原態(tài)氮源(-N和尿素)[11]，藻細(xì)胞蛋白質(zhì)中的氮呈還原態(tài)，利用或者有機(jī)態(tài)的氮源顯然比利用硝酸鈉中高氧化態(tài)的要經(jīng)濟(jì)．同時(shí)，對(duì)的吸收，能引起培養(yǎng)液中 pH 的下降，可以緩沖因光合作用而導(dǎo)致的藻液 pH上升，有利于藻類的生長[12]．而尿素除了能為微藻的生長提供氮源外，還能夠提供碳源．因此，在3種氮源中，氯化銨是最適合骨條藻生長的氮源，尿素次之，硝酸鈉最后．

當(dāng)營養(yǎng)鹽總水平足以滿足浮游植物生長時(shí)，海洋浮游植物的氮磷吸收比例基本上是遵循 Redfield比值N∶P＝16∶1，因此常用此比值來判斷浮游植物營養(yǎng)鹽的相對(duì)受限情況[13]．當(dāng)N/P＜16時(shí)，表明氮相對(duì)不足，N/P＞16時(shí)，表明磷相對(duì)不足．3種氮源最適合骨條藻生長的氮起始濃度都是 4.4×10-4mol/L，這時(shí)培養(yǎng)液中的氮磷比是13.74∶1，稍低于Redfield比值N∶P＝16∶1，表明處于缺氮狀態(tài)，但能滿足骨條藻生長的需要；當(dāng)?shù)獫舛冗_(dá)到 8.8×10-4,mol/L時(shí)，培養(yǎng)液中的氮磷比是27.48∶1，此時(shí)限制骨條藻生長的是磷元素．藻細(xì)胞利用-N作為氮源是不經(jīng)濟(jì)的，同時(shí)，過高濃度的和尿素對(duì)藻類是有毒的[12].因此，過高的3種氮源濃度對(duì)骨條藻的生長并無促進(jìn)作用，甚至?xí)种乒菞l藻的生長．

Spoehr和 Mihier[14]最早證明，氮缺乏可誘導(dǎo)Chiorella pyrenoidosa中脂類含量的增加，該現(xiàn)象后來在許多其他藻類中得到了證實(shí)．到目前為止，氮缺乏誘導(dǎo)脂類積累的相關(guān)機(jī)制還不清楚．微藻合成油脂大體上可以分為兩個(gè)階段，即細(xì)胞增殖期和油脂積累期，細(xì)胞增殖期是微藻消耗培養(yǎng)基中的氮源，合成蛋白質(zhì)，以保證藻體細(xì)胞代謝旺盛；接著藻體細(xì)胞開始大量消耗碳、氮源，并合成積累大量的油脂[15]．低氮培養(yǎng)基中的骨條藻基本都是在第 5天進(jìn)入油脂積累期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，氮源逐漸被消耗殆盡，細(xì)胞依次進(jìn)入氮饑餓的狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成代謝受到抑制而降低，相對(duì)的細(xì)胞內(nèi)油脂的合成得到了加強(qiáng)，在一定程度上也會(huì)提高微藻細(xì)胞的油脂含量[16]．因此，骨條藻的中性脂大量積累出現(xiàn)在培養(yǎng)后期．但當(dāng)培養(yǎng)到第 8天時(shí)，培養(yǎng)基中的各種營養(yǎng)元素均被大量消耗，無法為細(xì)胞的各種代謝過程提供充足的營養(yǎng)，使得細(xì)胞開始消耗自身的脂類維持生物量的穩(wěn)定，導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)油脂含量的降低．骨條藻是一種赤潮藻，有增殖快、衰退也快的特點(diǎn)，因此要利用它的脂類，需要選擇合適的采收時(shí)間．

4 結(jié) 論

最適合骨條藻的氮源是氯化銨，其次是尿素，最后是硝酸鈉，3種氮源最適合骨條藻生長的氮濃度都是 4.4×10-4,mol/L．最適合骨條藻中性脂積累的氮源是氯化銨，其最適濃度為 8.8×10-6,mol/L，其次是尿素，其最適濃度為 1.8×10-5,mol/L，最后是硝酸鈉，其最適濃度為 1.8×10-4,mol/L．在高接種量(106,mL-1)、使用 f/2培養(yǎng)基的條件下，不同濃度的氮源條件下骨條藻的最終生物量差距不大，通過調(diào)節(jié)氮源濃度可以使中性脂的積累量大幅度上升，油脂總量的高低與百分含量的高低基本一致．同時(shí)，氯化銨也是一種容易獲得的肥料，因此，用骨條藻生產(chǎn)生物能源，以氯化銨作為氮源是最適合的．

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