張開艷 吳沿友 李海濤 杭紅濤

摘 要：該研究以甘藍型油菜組培苗為材料，使用硝酸鈉來提供唯一氮源和鹽脅迫條件，測定甘藍型油菜組培苗的生物量、葉綠素含量和葉片穩(wěn)定碳同位素值，通過穩(wěn)定碳同位素值評估甘藍型油菜組培苗的自養(yǎng)能力，并基于自養(yǎng)能力研究甘藍型油菜組培苗的無機氮供應與鹽耐受能力的關(guān)系。結(jié)果表明：（1）供應40 mmol·L-1硝態(tài)氮能消除輕度鹽脅迫的不利影響，供應80 mmol·L-1硝態(tài)氮能有效緩減中度鹽脅迫的不利影響，但在重度鹽脅迫條件下，即使供應過量的無機氮，甘藍型油菜組培苗的生長仍然受到顯著的抑制。（2）甘藍型油菜組培苗的葉綠素含量隨鹽脅迫程度的增加而逐漸降低。（3）甘藍型油菜組培苗的自養(yǎng)能力在輕度鹽脅迫時達到最大， 但鹽脅迫程度的加劇會顯著降低甘藍型油菜組培苗的自養(yǎng)能力。由此可知，當植物的無機氮需求得到滿足后，自養(yǎng)能力的強弱將決定植物的鹽耐受能力，而過量的無機氮供應不能提高重度鹽脅迫條件下植物的自養(yǎng)能力。

關(guān)鍵詞： 甘藍型油菜組培苗，硝酸鈉，鹽脅迫，穩(wěn)定碳同位素，自養(yǎng)能力

中圖分類號：Q945.78

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2022）03-0422-07

Effect of inorganic nitrogen supply on the salt-tolerance

of Brassica napus plantlets in vitro

ZHANG Kaiyan1， 2， WU Yanyou2*， LI Haitao3， HANG Hongtao1， 2

（ 1. School of Karst Science， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China; 2. State Key Laboratory of Environmental

Geochemistry， Institute of Geochemistry， Chinese Academy of Sciences， Guiyang 550081， China; 3. Guizhou

Vocational College of Agriculture， Guiyang 551400， China ）

Abstract：The Brassica napus （Bn） plantlets in vitro were used as the experimental materials in this study. The sodium nitrate was employed to provide the sole nitrogen source and salt stress. The growth parameters， chlorophyll contents and foliar δ13C of B. napus plantlets were measured in this study. The photosynthetic capacity of B. napus plantlets was estimated by the stable carbon isotope value. The relationship between inorganic nitrogen supply and salt-tolerance of the B. napus plantlets was studied based on the photosynthetic capacity. The results were as follows： （1）The deleterious effect of slight salt stress could be counteracted by 40 mmol·L-1 sodium nitrate， while the deleterious effect of moderate salt stress could be effectively relieved by 80 mmol·L-1 sodium nitrate. However， even if the inorganic nitrogen supply was excessive， the growth of B. napus plantlets was heavily inhibited by the severe salt stress. （2）The chlorophyll contents of B. napus plantlets decreased gradually with increasing salt stress. （3）The photosynthetic capacity of B. napus plantlets reached the maximum under slight salt stress condition. However， the photosynthetic capacity of B. napus plantlets decreased obviously with increasing salt stress. Hence， when the inorganic nitrogen demand is met for plants， the salt-tolerance of plants will depend on the photosynthetic capacity. Excessive inorganic nitrogen supply can not improve the photosynthetic capacity of plants suffered from the severe salt stress.

Key words： Brassica napus plantlets， sodium nitrate， salt stress， stable carbon isotope， photosynthetic capacity

鹽脅迫是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因子之一。當前，世界范圍內(nèi)有將近20%的耕地存在不同程度的鹽漬化（Munns &? Tester，2008;Zhao et al.，2015 ），而中國的鹽漬化土地面積約為3 460萬hm2（Zhou et al.，2018）。飽和土壤提取液的電導率大于4 dS·m-1 （粗略對應40 mmol·L-1鈉）的土壤就被認為是鹽漬土（Munns & Tester，2008）。在鹽漬化土壤中，鈉鹽的含量占主導地位（Tavakkoli et al.，2010）。鈉鹽通常不是植物生長所必需的，土壤中高濃度的鈉鹽將對植物產(chǎn)生滲透脅迫和離子毒害效應（Munns & James，2006;Munns & Tester，2008）。根據(jù)植物對鹽脅迫的忍受程度，植物通常被分為鹽生植物和非鹽生植物。然而，目前大多數(shù)農(nóng)作物均屬于非鹽生植物（Wu，2018）。非鹽生植物對鹽濃度很敏感，25～50 mmol·L-1的鈉離子濃度就會抑制其生長（Haro et al.，1993）。

植物在遭受鹽脅迫時通常會合成大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來緩解鹽脅迫帶來的不利影響，合成的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)一般是脯氨酸、甜菜堿和胺類物質(zhì)等含氮物質(zhì)（Siddiqui et al.， 2010;Muchate et al.，2016;Negro et al.，2017）。然而，鹽脅迫環(huán)境中又普遍存在無機氮供應不足的情況（Amonkar & Karmarkar，1995）。因此，為了避免農(nóng)作物遭受鹽脅迫的不利影響，普遍措施是增施氮肥來提高農(nóng)作物對鹽脅迫的耐受程度（Hessini et al.，2019），同時增加無機氮的供應還能顯著促進植物的光合能力（Liu et al.，2013），為植物生長提供更多的能量。

雖然無機氮的供應為含氮物質(zhì)的合成提供了氮源，但處于鹽脅迫條件下的植物還會遭受鈉離子的毒害，而植物將鈉離子排除體外的過程需要消耗能量（Apse & Blumwald，2007）。由于植物所需的能量來自光合作用，因此在鹽脅迫條件下，光合能力強的植物將有較大的鹽耐受能力，反之則植物的鹽耐受能力較弱。

植物光合能力的強弱通常是利用便攜式光合儀來測定，但光合儀僅能給出植物瞬時的光合能力，若要獲取植物在整個鹽脅迫期間的光合能力則需要每天進行測定。然而，在植物組織培養(yǎng)條件下，可以通過測定組培苗的葉片穩(wěn)定碳同位素值來確定組培苗在整個生長周期內(nèi)的自養(yǎng)能力（光合能力）（Serret et al.， 1997）。因此，本研究采用植物組織培養(yǎng)來研究鹽脅迫條件下植物的光合能力。

通常，植物吸收利用的無機氮主要是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮。雖然植物直接吸收利用銨態(tài)氮能省掉硝態(tài)氮的還原過程，消耗的能量較小，但是大多數(shù)植物吸收利用的無機氮主要是硝態(tài)氮。此外，植物在遭受高濃度的硝態(tài)氮供應時幾乎不會發(fā)生硝酸鹽毒害現(xiàn)象（Cruz et al.，2006;Hessini et al.，2009）。鑒于此，本研究使用硝酸鈉來提供唯一氮源和鹽脅迫條件。由于甘藍型油菜在生長過程中的氮需求量大，且是廣泛種植的油料作物，因此本研究選擇無根甘藍型油菜組培苗作為實驗材料，測定處于增殖階段的甘藍型油菜組培苗在不同硝酸鈉濃度下的生長情況、葉綠素含量和葉片穩(wěn)定碳同位素值，旨在研究鹽脅迫條件下甘藍型油菜組培苗的自養(yǎng)能力與無機氮供應的關(guān)系，為通過無機氮管理來提高甘藍型油菜的鹽耐受能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為繼代培養(yǎng)4代后的無根甘藍型油菜組培苗（單芽），帶有4個未展開的葉片，單芽均重為0.08 g。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計 將甘藍型油菜組培苗接種于增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的類型為MS培養(yǎng)基，硝態(tài)氮是MS培養(yǎng)基中的唯一氮源，使用硝酸鈉來提供硝態(tài)氮。設(shè)置5個硝酸鈉濃度，分別是10、20、40、80和120 mmol·L-1。10、20 mmol·L-1硝酸鈉濃度下的鹽脅迫程度視為無，40 mmol·L-1硝酸鈉濃度對應輕度鹽脅迫，80 mmol·L-1硝酸鈉濃度對應中度鹽脅迫，120 mmol·L-1硝酸鈉濃度對應重度鹽脅迫。培養(yǎng)基中細胞分裂素6-BA 的濃度為2.0 mg·L-1，生長素NAA 的濃度為0.2 mg·L-1。在此細胞分裂素和生長素濃度比例下，甘藍型油菜組培苗在整個增殖階段沒有根的生成。培養(yǎng)基蔗糖含量為30 g·L-1，瓊脂粉含量為7.5 g·L-1。首先調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值到5.8，每個三角瓶分裝50 mL培養(yǎng)基，用封口膜密封;然后將培養(yǎng)基放置于高壓滅菌鍋中，在121 ℃下滅菌20 min。組培室的光周期為12 h，光照強度為50 μmol·m-2·s-1 PPFD，培養(yǎng)室溫度為（25 ± 2）℃。

1.2.2 組培苗生長參數(shù)測定 組培苗的初始鮮重通過稱重的方式測定。先稱量未轉(zhuǎn)接組培苗的培養(yǎng)基重量，再稱量轉(zhuǎn)接組培苗后的培養(yǎng)基重量，2次稱量的差值即為接種組培苗的初始鮮重。

經(jīng)過5周培養(yǎng)后，從三角瓶中取出組培苗，測定組培苗的鮮重，組培苗的鮮重減去初始鮮重即為甘藍型油菜組培苗的增重。將組培苗的葉片剪下并于108 ℃殺青半小時，接著在60 ℃恒溫下烘干，隨后將烘干后葉片搗碎為粉末。

1.2.3 組培苗葉綠素含量測定 首先，將0.1 g組培苗葉片放入研缽中，倒入一定量的液氮，充分研磨后在研缽中加入5 mL 95%分析純乙醇，將葉綠素提取液轉(zhuǎn)入15 mL離心管中;然后，用5 mL 95%分析純乙醇涮洗研缽，將涮洗研缽后的95%分析純乙醇轉(zhuǎn)入15 mL離心管中。將裝有葉綠素提取液的離心管于4 ℃冰箱中靜置24 h以上，待葉片組織變?yōu)榘咨?，先在離心機中進行離心，再進行葉綠素含量的測定。用分光光度計在665 nm和649 nm處測定葉綠素的吸光度，根據(jù)Alsaadawi 等（1986）的公式計算葉綠素的含量。

1.2.4 組培苗葉片穩(wěn)定碳同位素測定 組培苗葉片穩(wěn)定碳同位素比值（δ13C）通過氣體同位素質(zhì)譜儀（MAT253，Germany）進行測定，采用連續(xù)流模式。將20 μg葉片碳和相對應的碳標準物質(zhì)分別包入錫杯中。首先，將包好的樣品放入自動進樣器中進行測定;然后，測定穩(wěn)定碳同位素值。穩(wěn)定碳同位素值用δ表示，計算公式如下：

δ13C （‰）=（Rsample/Rstandard-1）×1 000 （1）

式中： Rsample 為甘藍型油菜組培苗葉片的同位素比值（13C/12C）;Rstandard為標準物質(zhì)的同位素比值。測定穩(wěn)定碳同位素時用IAEA-CH-3 和IAEA-CH-6 進行校正（Yousfi et al.，2013）。MAT253測定穩(wěn)定碳同位素值的精度為0.2‰。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 所有測量的數(shù)據(jù)均用平均值 ± 標準差表示，對各處理間數(shù)據(jù)進行單因子顯著性差異分析（P<0.05）。文中的圖用Origin 軟件（9.0 版本）繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硝酸鈉濃度對甘藍型油菜組培苗生長的影響

甘藍型油菜組培苗培養(yǎng)5周后的生長情況見表1。由表1可知，硝酸鈉濃度對甘藍型油菜組培苗的生長具有顯著的影響;隨著硝酸鈉濃度的增加，甘藍型油菜組培苗的增重呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢;甘藍型油菜組培苗遭受輕度鹽脅迫時，供應40 mmol·L-1硝態(tài)氮能消除輕度鹽脅迫的不利影響;供應80 mmol·L-1的硝態(tài)氮能夠有效緩減中度鹽脅迫的不利影響。但是，當鹽脅迫的程度達到最大時，過量的硝態(tài)氮供應也不能明顯改善重度鹽脅迫對甘藍型油菜組培苗生長的抑制。

此外，鹽脅迫的程度還會影響甘藍型油菜組培苗芽的增殖效果，在中度和重度鹽脅迫條件下，甘藍型油菜組培苗的增殖效果最差，而輕度鹽脅迫則對甘藍型油菜組培苗的增殖不產(chǎn)生顯著影響。

2.2 不同硝酸鈉濃度對甘藍型油菜組培苗葉綠素含量的影響

甘藍型油菜組培苗葉片的葉綠素含量受到硝態(tài)氮供應量和鹽脅迫程度的共同影響。從表2可以看出，隨著硝酸鈉濃度的增加，總?cè)~綠素含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。在10～40 mmol·L-1硝酸鈉濃度范圍內(nèi)，繼續(xù)增加無機氮的供應能明顯提高葉片總?cè)~綠素的含量。然而，隨著鹽脅迫程度的加強（輕度至重度鹽脅迫），繼續(xù)增加無機氮的供應對提高葉片總?cè)~綠素含量無效， 且重度鹽脅迫對甘藍型油菜組培苗葉綠素合成的抑制作用最明顯。

2.3 不同硝酸鈉濃度對甘藍型油菜組培苗葉片穩(wěn)定碳同位素值的影響

硝酸鈉的供應量對甘藍型油菜組培苗的葉片穩(wěn)定碳同位素值有顯著的影響。如圖1所示，隨著硝酸鈉濃度的增加，甘藍型油菜組培苗的葉片穩(wěn)定碳同位素值呈現(xiàn)先緩慢變小后急劇增大的趨勢，在40 mmol·L-1硝酸鈉濃度時的葉片穩(wěn)定碳同位素值達到最小，而在最高硝酸鈉濃度供應下獲得最大的葉片穩(wěn)定碳同位素值。甘藍型油菜組培苗的葉片穩(wěn)定碳同位素值隨著鹽脅迫程度的加強而顯著增大。

3 討論與結(jié)論

由于鹽脅迫是限制農(nóng)作物生長和產(chǎn)量的主要環(huán)境因子，因此在鹽漬土上種植的農(nóng)作物將因為鹽脅迫的存在而導致其生長受到抑制，從而影響農(nóng)作物的產(chǎn)量（Liang et al.，2019）。通常，遭受鈉鹽脅迫的植物除了受到滲透脅迫的逆境外，鈉離子的毒害作用也是抑制植物生長的主要因素（Parida & Das，2005）。本研究結(jié)果表明，重度鹽脅迫顯著抑制了甘藍型油菜組培苗的生長，而甘藍型油菜組培苗在輕度和中度鹽脅迫條件下生長的改善可能歸功于硝態(tài)氮供應量的增加。雖然鹽脅迫的加劇會導致硝酸還原酶活力的下降（Kaiser & Huber，2001），但在本研究中，隨著鹽脅迫程度的加劇，硝態(tài)氮的供應量也隨之增加。硝態(tài)氮供應量的增加能提高硝酸還原酶的活力（Kaiser & Huber，2001;Black et al.，2002）。Zhang & Wu（2017）的研究也表明隨著硝酸鈉濃度的增加，甘藍型油菜組培苗的葉片氮含量顯著增加。因此，硝態(tài)氮供應量的增加能提高葉片的氮含量。在鹽脅迫條件下，當植物的無機氮供應量大于植物正常生長所需量后，植物體內(nèi)一般會合成大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來應對鹽脅迫的不利影響（Carillo et al.， 2005）。重度鹽脅迫條件下甘藍型油菜組培苗生長的抑制可能還與鈉離子的毒害作用相關(guān)聯(lián)。

在鹽脅迫條件下，植物為了減輕鈉離子的毒害效應，會盡可能將過多的鈉離子排除體外，但這是一個消耗能量的過程（Apse & Blumwald，2007）。此外，鹽脅迫還會抑制葉綠素的合成（Parida & Das，2005），并導致植物的光合速率降低（Yousfi et al.， 2009）。在本研究中，硝態(tài)氮供應量隨著鹽脅迫程度的加劇而相應增加，而增加無機氮的供應又能促進葉綠素含量的增加（Guidi et al.，1997）。因此，甘藍型油菜組培苗在遭受輕度和中度鹽脅迫時仍然能保持較高的葉綠素含量，而在120 mmol·L-1硝酸鈉濃度處理下獲得的最小葉綠素濃度可能是加劇的鹽脅迫增強了葉綠素降解酶的活力所致（Rao GG & Rao GR，1981）。

葉綠素含量通常能間接指示植物的光合能力，低濃度的葉綠素含量會直接限制植物的光合能力，從而導致初級生產(chǎn)力的降低（Filella et al.，1995）。然而，限制光合能力的因素除了葉綠素含量外，還有葉片氣孔導度、二氧化碳濃度和光照強度等因素。在本研究中，不同硝酸鈉濃度處理下的甘藍型油菜組培苗生長條件一致，甘藍型油菜組培苗同時進行自養(yǎng)生長和異養(yǎng)生長，甘藍型油菜組培苗有兩個明顯的碳源，一個是以蔗糖為碳源的有機碳源，另一個是以空氣二氧化碳為碳源的無機碳源?？諝庵械亩趸冀?jīng)植物光合作用后將產(chǎn)生20‰的分餾（O′Leary，1981），本研究測定組培室空氣二氧化碳的穩(wěn)定碳同位素值為-10.55‰。因此，組培苗利用空氣二氧化碳后，這部分被利用的二氧化碳在植物葉片內(nèi)的光合產(chǎn)物將有很偏負的穩(wěn)定碳同位素值。培養(yǎng)基中蔗糖的穩(wěn)定碳同位素值為-12.65‰，而本研究測定的甘藍型油菜組培苗利用蔗糖發(fā)生的穩(wěn)定碳同位素分餾值僅為2.54‰。因此，甘藍型油菜組培苗同時利用蔗糖和空氣二氧化碳得到的葉片穩(wěn)定碳同位素值將是兩個明顯不同的穩(wěn)定碳同位素值混合的結(jié)果。甘藍型油菜組培苗利用空氣二氧化碳的量越多，則葉片穩(wěn)定碳同位素值就會越偏負，而葉片穩(wěn)定碳同位素值越偏負，則表明甘藍型油菜組培苗的自養(yǎng)能力越強，反之則越弱。甘藍型油菜組培苗在40 mmol·L-1硝酸鈉濃度處理下的葉片穩(wěn)定碳同位素值最偏負意味著甘藍型油菜組培苗雖遭受輕度鹽脅迫，但仍然能獲得最大的自養(yǎng)能力，這可能歸功于相應增加的無機氮供應促進了葉片葉綠素含量的增加，從而增大了二氧化碳的同化量。然而，甘藍型油菜組培苗在80 mmol·L-1硝酸鈉濃度處理下的葉綠素含量明顯高于20 mmol·L-1硝酸鈉濃度處理下的葉綠素含量，但此時的葉片穩(wěn)定碳同位素值卻稍微大于20 mmol·L-1硝酸鈉濃度處理下的葉片穩(wěn)定碳同位素值;此外，甘藍型油菜組培苗在120 mmol·L-1硝酸鈉濃度處理下的葉綠素含量接近10 mmol·L-1硝酸鈉濃度處理下的葉綠素含量，但120 mmol·L-1硝酸鈉濃度處理下的葉片穩(wěn)定碳同位素值卻顯著大于10 mmol·L-1硝酸鈉濃度處理下的葉片穩(wěn)定碳同位素值。因此，在本研究中，隨著鹽脅迫程度的加劇，甘藍型油菜組培苗的葉片穩(wěn)定碳同位素值逐漸增大是鹽脅迫程度加強導致氣孔關(guān)閉所致。鹽脅迫程度的加強會導致葉片氣孔關(guān)閉，從而導致葉片同化二氧化碳的量降低（Meloni et al.，2003），與對照相比，鹽脅迫下植物通常有較正的δ13C 值（Amor & Cuadra-Crespo，2011），在最高硝酸鈉濃度處理下的甘藍型油菜組培苗遭受最強的鹽脅迫，此時甘藍型油菜組培苗自養(yǎng)能力最小應歸功于氣孔導度的限制。因此，隨著鹽脅迫程度的加劇，甘藍型油菜組培苗同化二氧化碳的量是在逐漸降低。Zhang & Wu（2017）的研究表明，在40 mmol·L-1至120 mmol·L-1硝酸鈉濃度范圍內(nèi)，隨著硝酸鈉濃度的增加，甘藍型油菜組培苗的葉片碳含量顯著下降，而葉片碳含量低意味有機碳的積累量少。因此，甘藍型油菜組培苗在重度鹽脅迫條件下利用蔗糖的量也少。相應地，甘藍型油菜組培苗在重度鹽脅迫條件下獲得的能量最小。

隨著鹽脅迫程度的加劇，甘藍型油菜組培苗的自養(yǎng)能力逐漸減弱，而遭受的鈉離子毒害效應則逐漸增強。此外，Zhang & Wu（2017）的研究發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜組培苗的葉片氮含量在120 mmol·L-1硝酸鈉濃度處理下達到最大，是無鹽脅迫條件下葉片氮含量的2倍以上，而葉片最大氮含量則意味著同化無機氮所需能量也最大。然而，甘藍型油菜組培苗在120 mmol·L-1硝酸鈉濃度處理下的自養(yǎng)能力顯著低于無鹽脅迫時的自養(yǎng)能力，自養(yǎng)能力弱意味著為植物提供的能量少，而鹽脅迫加強又會加劇能量的消耗，這就導致了重度鹽脅迫條件下甘藍型油菜組培苗的生長受到了顯著的抑制。

綜上所述，植物的生長情況與遭受的鹽脅迫程度相關(guān)聯(lián)。在甘藍型油菜組培苗遭受鹽脅迫時，40 mmol·L-1的硝態(tài)氮供應能消除輕度鹽脅迫的不利影響，80 mmol·L-1的硝態(tài)氮供應能有效緩減中度鹽脅迫的不利影響，但在重度鹽脅迫條件下，即使供應過量的無機氮，甘藍型油菜組培苗的生長也還是受到顯著抑制。因此，在植物遭受輕度或中度鹽脅迫時，增加無機氮的供應量能提高植物對鹽脅迫的耐受能力，從而顯著降低鹽脅迫的不利影響。然而，之所以在重度鹽脅迫條件下，即使供應過量的無機氮也不能降低重度鹽脅迫對植物生長的抑制，是因為過量的無機氮供應并不能為遭受重度鹽脅迫的植物提供充足的能量，相反，大量的氮同化還會加劇植物的能量消耗。

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（責任編輯 蔣巧媛）

收稿日期：2020-12-15

基金項目：國家“十三五”重點研發(fā)計劃課題（2016YFC0502607）;貴州省科學技術(shù)基金（黔科合基礎(chǔ)[2020]1Y172）;國家自然科學基金重點項目（U1612441-2）;貴州師范大學2018年博士科研啟動項目（GZNUD[2018]30號）[Supported by National Key Research and Development Program of China in the 13th Five-Year Plan（2016YFC0502607）; Guizhou Provincial Science and Technology Foundation （[2020]1Y172）; National Natural Science Foundation of China （U1612441-2）; Doctor Foundation Program of Guizhou Normal University in 2018（GZNUD[2018]30）]。

第一作者： 張開艷（1989-），博士，講師，主要從事植物的無機氮利用機制研究，（E-mail）kaiyanzhang@126.com。

通信作者：吳沿友，博士，研究員，博士研究生導師，主要從事生態(tài)環(huán)境和環(huán)境地球化學研究，（E-mail）wuyanyou@mail.gyig.ac.cn。