趙寧,黃永吉,馬廣斌,嚴(yán)冬雪

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱骨病外科,桂林 541000)

·血液系統(tǒng)疾病用藥專欄·

鞣花酸對(duì)骨髓瘤SP2/0細(xì)胞的作用

趙寧,黃永吉,馬廣斌,嚴(yán)冬雪

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱骨病外科,桂林 541000)

目的 探討五倍子提取物鞣花酸抗骨髓瘤的生物學(xué)活性及相關(guān)機(jī)制。方法20,40和60 μg·mL-1鞣花酸體外孵育骨髓瘤SP2/0細(xì)胞株,采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)鞣花酸對(duì)SP2/0細(xì)胞株增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響,通過Western blotting技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)基因COX-2的表達(dá)。結(jié)果20,40, 60 μg·mL-1鞣花酸孵育骨髓瘤SP2/0細(xì)胞株48 h后,細(xì)胞周期阻滯于G1期,G1期細(xì)胞百分率分別為(55.21±3.01)%, (64.48±0.43)%,(75.10±2.46)%,與對(duì)照組(34.04±1.74)%比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。20,40和60 μg·mL-1鞣花酸細(xì)胞抑制率分別為(21.18±5.92)%,(44.58±3.43)%和(70.15±2.90)%,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。細(xì)胞早期凋亡率分別為(9.60±0.56)%,(19.30±1.51)%和(35.10±5.26)%,與對(duì)照組(3.23± 0.85)%比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),隨藥物濃度的增加COX-2的表達(dá)逐漸下降。結(jié)論鞣花酸能夠抑制骨髓瘤SP2/0細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。

鞣花酸;骨髓瘤;SP2/0細(xì)胞;增殖;凋亡

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)好發(fā)于中老年人,其發(fā)病率有明顯的地域性差異,近幾年歐美國家發(fā)病率每10萬人約為4例,約為我國的4倍[1]。多發(fā)性骨髓瘤患者多數(shù)以腰骶部及胸部疼痛為首發(fā)癥狀,誤診率及死亡率較高,目前其病因以及發(fā)病機(jī)制尚未清楚,治療效果欠佳[2]。因此,尋找有效的抗骨髓瘤藥物與防治方法已是骨髓瘤研究的重要課題[3]。鞣花酸是一種天然多酚,存在于五倍子等多種中草藥和水果中,它是多環(huán)芳烴誘變作用的拮抗劑,也是腫瘤的抑制劑,其抗氧化、抗突變和抗癌的活性已初步得到證實(shí),鞣花酸是潛在的抗腫瘤藥物[4-6]。目前,五倍子提取物鞣花酸抗骨髓瘤的研究筆者尚未見報(bào)道。本研究通過對(duì)鞣花酸抗骨髓瘤生物學(xué)活性的研究,為臨床應(yīng)用鞣花酸防治骨髓瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供,鞣花酸粉(批號(hào):10148850)由Alfa公司提供,四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT]、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、碘化丙啶(propidiumiodide,PI)為美國Sigma公司產(chǎn)品,RPMI-1640、小牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品,兔抗人COX-2抗體由Bioworld公司提供,Hoechst33258、ECL發(fā)光液、β-actin抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)、山羊抗兔IgG二抗和辣根過氧化物酶山羊抗小鼠IgG二抗由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 骨髓瘤SP2/0細(xì)胞株培養(yǎng)于10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中,每毫升含青霉素80 U及鏈霉素100 U,置37℃、5%二氧化碳(CO2)的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 藥物配備 稱取鞣花酸粉50 mg,連同稱量紙置于無菌超凈操作臺(tái)上,在紫外燈下照射1 h后,倒入高壓滅菌過的玻璃瓶中,加入DMSO 10 mL,震蕩、搖勻,使鞣花酸充分溶解,經(jīng)過內(nèi)徑0.22 μm微孔過濾器過濾,然后將DMSO溶液配制的5 μg·mL-1鞣花酸溶液分裝于2 mL EP管中,在4℃下保存。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè) SP2/0細(xì)胞接種于6孔板,接種密度為每孔1×106個(gè),每孔培養(yǎng)液2.0 mL。觀察組分別加入終濃度為20,40和60 μg·mL-1鞣花酸,對(duì)照組不加鞣花酸孵育,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48 h后,置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀況并攝像。去培養(yǎng)液后,每孔加入4%多聚甲醛0.5～1.0 mL,室溫下固定10 min。去固定液,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)洗2次,每孔加入適量Hoechst33258染料,染色10 min。PBS洗2次后,加一滴抗熒光淬滅封片液,然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封片。制作好的細(xì)胞染色片置熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞并攝像。

1.5 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 細(xì)胞密度為1× 105個(gè)·mL-1的對(duì)數(shù)生長期單細(xì)胞懸液接種于96孔板,每孔0.2 mL,培養(yǎng)過夜后,觀察組細(xì)胞加入鞣花酸至終濃度分別為20,40和60 μg·mL-1,對(duì)照組加入等量藥物溶劑,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,孵育48 h后,每孔加入5 μg·mL-1MTT 20 μL,孵育4 h。去上清液,每孔加入DMSO 200 μL,振蕩器上輕輕振蕩5～10 min,使結(jié)晶完全溶解,置波長490 nm酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,細(xì)胞增殖抑制率(%)= (對(duì)照組A值-觀察組A值)/(對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%。

1.6 細(xì)胞早期凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期骨髓SP2/0細(xì)胞,觀察組加入鞣花酸至終濃度分別20,40, 60 μg·mL-1,孵育培養(yǎng)24 h后,PBS洗滌1次,收集細(xì)胞,分別加入1×Binding Buffer 100 μL,懸浮細(xì)胞,加入Annexin V 3 μL和PI 3 μL,室溫避光1 h,再加入1 ×Binding Buffer100 μL,流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞早期凋亡。

1.7 細(xì)胞周期檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長期的骨髓瘤SP2/0細(xì)胞接種100 μL培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)過夜,觀察組加入鞣花酸至終濃度分別20,40,60 μg·mL-1,孵育培養(yǎng)48 h后,PBS洗滌2次,收集細(xì)胞,轉(zhuǎn)入離心管,2 325×g離心10 min,PBS洗滌2次后,加入預(yù)冷70%乙醇(無水乙醇+PBS配制)4℃固定過夜。調(diào)整細(xì)胞濃度至106個(gè)·mL-1,取懸液1 mL,2 325×g離心10 min,PBS洗滌2次;棄上清液,加入RNase A 20 μL,37℃水浴30 min,加入終濃度為50 μg·mL-1PI染液1 mL懸浮細(xì)胞,4℃避光30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.8 Western blotting技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá) 收集不同藥物濃度處理48 h的SP2/0細(xì)胞,分別加入蛋白裂解液后置碎冰上15 min,超聲波處理,4℃下22 065×g離心30 min;分離上清液,采用BCA法測(cè)定上清液總蛋白濃度;取上清液總蛋白50 μg與上樣緩沖液混合,置沸水浴10 min,上樣后進(jìn)行電泳;采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,5%脫脂奶粉(TBST配置)封閉1 h,加入一抗(1∶500),30℃搖蕩2 h,TBST洗膜3次,加入HRP標(biāo)記的二抗,30℃,搖蕩2 h,TBST洗膜3次;采用電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence, ECL)液進(jìn)行發(fā)光,壓片、顯影、定影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組資料比較采用完全隨機(jī)的單因素(One-Way ANOVA)方差分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鞣花酸對(duì)SP2/0細(xì)胞形態(tài)的影響 20,40和60 μg·mL-1鞣花酸孵育SP2/0細(xì)胞48 h后,細(xì)胞增殖均受抑制,形態(tài)也發(fā)生改變:對(duì)照組貼壁細(xì)胞多,細(xì)胞大小均勻,輪廓清楚,細(xì)胞間接觸緊密;鞣花酸孵育組,隨藥物濃度增加,貼壁細(xì)胞逐漸減少,細(xì)胞變圓,漂浮的死亡細(xì)胞增多(圖1)。Hoechst33258染色顯示,對(duì)照組細(xì)胞核染色均勻,鞣花酸孵育組細(xì)胞核強(qiáng)染色、核固縮細(xì)胞比例隨鞣花酸的濃度增加而升高,細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密濃染的顆粒狀或條塊狀熒光染色(圖2)。

2.2 鞣花酸對(duì)SP2/0細(xì)胞增殖的影響 終濃度為20,40和60 μg·mL-1鞣花酸孵育骨髓瘤SP2/0細(xì)胞48 h,細(xì)胞增殖均受抑制,抑制率分別為(21.18± 5.92)%,(44.58±3.43)%和(70.15±2.90)%,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。隨藥物濃度的升高,細(xì)胞的抑制率增加。

2.3 鞣花酸對(duì)SP2/0細(xì)胞早期凋亡影響 終濃度為20,40和60 μg·mL-1鞣花酸孵育骨髓瘤SP2/0細(xì)胞24 h,細(xì)胞早期凋亡率分別為(9.60±0.56)%, (19.30±1.51)%和(35.10±5.26)%,與對(duì)照組(3.23±0.85)%比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Q4象限早期凋亡細(xì)胞隨藥物濃度增加而增多。見圖3。

2.4 鞣花酸對(duì)SP2/0細(xì)胞周期的影響 終濃度為20, 40和60 μg·mL-1鞣花酸孵育骨髓瘤SP2/0細(xì)胞48 h,細(xì)胞阻滯于G1期,隨藥物濃度的增高G1期細(xì)胞百分率也逐漸增加,分別為(55.21±3.01)%,(64.48±0.43)%, (75.10±2.46)%,與對(duì)照組的(34.04±1.74)%比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見圖4。

A.對(duì)照組;B.20 μg·mL-1鞣花酸組;C.40 μg·mL-1鞣花酸組;D.60 μg·mL-1鞣花酸組圖1 顯微鏡觀察細(xì)胞生長形態(tài)(×200)A.control group;B.20 μg·mL-1ellagic acid group;C.40 μg·mL-1ellagic acid group;D.60 μg·mL-1ellagic acid groupFig.1 Cell morphology detected by microscopic examination(×200)

A.對(duì)照組;B.20 μg·mL-1鞣花酸組;C.40 μg·mL-1鞣花酸組;D.60 μg·mL-1鞣花酸組圖2 Hoechst33258熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡(×200)A.control group;B.20 μg·mL-1ellagic acid group;C.40 μg·mL-1ellagic acid group;D.60 μg·mL-1ellagic acid groupFig.2 Cell apoptosis detected by Hoechst33258 fluorescence staining(×200)

A.對(duì)照組;B.20 μg·mL-1鞣花酸組;C.40 μg·mL-1鞣花酸組;D.60 μg·mL-1鞣花酸組圖3 以Annexin FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率A.control group;B.20 μg·mL-1ellagic acid group;C.40 μg·mL-1ellagic acid group;D.60 μg·mL-1ellagic acid groupFig.3 Cell apoptosis rate at early phase detected by Annexin FITC/PI staining

A.對(duì)照組;B.20 μg·mL-1鞣花酸組;C.40 μg·mL-1鞣花酸組;D.60 μg·mL-1鞣花酸組圖4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期A.control group;B.20 μg·mL-1ellagic acid group;C.40 μg·mL-1ellagic acid group;D.60 μg·mL-1ellagic acid groupFig.4 Cell Cycle detected by flow cytometry

2.5 鞣花酸處理后的SP2/0細(xì)胞COX-2基因表達(dá)情況 20,40和60 μg·mL-1鞣花酸孵育SP2/0細(xì)胞48 h后,COX-2的表達(dá)抑制情況呈梯度性增強(qiáng)。見圖5。

A.對(duì)照組;B.20 μg·mL-1鞣花酸組;C.40 μg·mL-1鞣花酸組;D.60 μg·mL-1鞣花酸組圖5 Western blotting印跡分析COX-2的表達(dá)情況A.control group;B.20 μg·mL-1ellagic acid group;C. 40 μg·mL-1ellagic acid group;D.60 μg·mL-1ellagic acid groupFig.5 COX-2 expression detected by western blotting

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是一種克隆性漿細(xì)胞異常增生的惡性疾病,其中骨髓瘤骨病(myeloma bone disease,MBD)是其主要并發(fā)癥,主要與腫瘤細(xì)胞破壞了骨的正常代謝有關(guān),臨床上表現(xiàn)為高鈣血癥、病理性骨折、骨痛以及頸、腰椎相關(guān)壓迫癥狀。MBD發(fā)病隱匿,無特異性表現(xiàn),臨床誤診率較高,現(xiàn)階段主要以雙膦酸鹽聯(lián)合化療、手術(shù)治療為主,但很難治愈,患者死亡率較高[3]。因此,探索有效的防治骨髓瘤的藥物和方法是廣大醫(yī)務(wù)工作者和研究人員面臨的重要課題。

LESCA[4]研究植物酚類化合物阿魏酸、綠原酸和鞣花酸抗癌作用,發(fā)現(xiàn)鞣花酸對(duì)抗環(huán)芳烴化合物的致癌作用強(qiáng),綠原酸次之,阿魏酸較弱,認(rèn)為天然植物酚類物質(zhì)一般對(duì)機(jī)體無害,再者,這類天然抗致癌物質(zhì)廣泛地存在于人類的食物之中,在食物中尋找抗癌藥物是一種實(shí)用的途徑。VADHANAM等[5]報(bào)道,鞣花酸的皮下注射或口服給藥均能推遲雌激素誘導(dǎo)乳腺腫瘤晚2至3周發(fā)生,并且能降低腫瘤的發(fā)病率和抑制腫瘤生長。KIM等[7]研究發(fā)現(xiàn),含有1%鞣花酸脫乙酰殼多糖凝膠顯著降低腦瘤U87細(xì)胞和C6細(xì)胞的生存能力。向秋等[8]研究五倍子提取物鞣花酸對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞的生物學(xué)作用,鞣花酸對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖作用具有劑量依賴性。LI等[9]用鞣花酸孵育膀胱癌T24細(xì)胞能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。MALIK等[6]報(bào)道,鞣花酸通過caspase途徑抑制前列腺癌PC3細(xì)胞,誘發(fā)細(xì)胞凋亡。楊洪亮等[10]將小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6用鞣花酸孵育48 h,細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。王建紅等[11]報(bào)道五倍子提取物鞣花酸劑量依賴性抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞細(xì)胞增殖,細(xì)胞被阻滯在G1期,隨著藥物濃度增加,G1期細(xì)胞百分率增高,凋亡細(xì)胞增多。本研究結(jié)果表明鞣花酸對(duì)骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的增殖有較強(qiáng)的抑制作用,60 μg·mL-1鞣花酸孵育細(xì)胞48 h,細(xì)胞的增殖抑制率高達(dá)70.15%。流式細(xì)胞儀分析,細(xì)胞阻滯在G1期,隨鞣花酸濃度增加,G1期細(xì)胞所占百分率增多,與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致,但其相關(guān)性的具體機(jī)制需進(jìn)一步探討。

COX-2屬于誘導(dǎo)酶,正常細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較低甚至不表達(dá),但在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)活躍。關(guān)于COX-2的研究表明,COX-2可促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,抑制其凋亡,增加腫瘤組織內(nèi)新生血管生成,增強(qiáng)了腫瘤的侵襲性。COX-2對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的作用可能存在不同的機(jī)制, KRYSAN等[12]報(bào)道非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中凋亡抑制蛋白(IAP)survivin的穩(wěn)定性增強(qiáng)與COX-2的表達(dá)具有正相關(guān)性。而結(jié)腸癌HCA細(xì)胞中,COX-2可促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá),但對(duì)誘導(dǎo)腫瘤凋亡的Bax蛋白表達(dá)無影響[13],從而由更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2二聚體替代Bax-Bax同源二聚體,使Bax-Bax同源二聚體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力減弱[14]。本實(shí)驗(yàn)表明,鞣花酸可下調(diào)骨髓瘤SP2/0細(xì)胞中COX-2的表達(dá),從而促進(jìn)其凋亡。

鞣花酸在腫瘤細(xì)胞膜上的聚集依賴于pH,最初形成的微球逐漸聚合轉(zhuǎn)變成微纖維,在pH 6～8的范圍內(nèi)能生成最適長度微纖,能有效粘附到HeLa細(xì)胞膜上,有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖[15]。鞣花酸等植物多酚在腫瘤細(xì)胞膜上的聚集特性,可以用于腫瘤細(xì)胞的直接給藥,其抗腫瘤效果較好,可能為MM的防治提供新方法。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.017

Effect of Ellagic Acid on Myeloma SP2/0 Cells

ZHAO Ning,HUANG Yong-ji,MA Guang-bin,YAN Dong-xue
(Department of Spine Surgery,Guilin Medical College Hospital,Guilin 541000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of ellagic acid extracted from gallnut on multiple myeloma SP2/0 cell line and related mechanisms.MethodsMultiple myeloma SP2/0 cell line was treated for 48 h with different concentrations of ellagic acidin vitro.Cell morphology,proliferation,apoptosis and cell cycle were analyzed with microscope,MTT experiment and flow cytometry,respectively.Tumor cell proliferation and apoptosis-related gene expression of COX-2 were detected by Western blotting.ResultsCell cycle was arrested at the G1phase 48 h after treatment with ellagic acid,the cell in G1were(55.21± 3.01)%,(64.48±0.43)%,(75.10±2.46)%,respectively,with significant difference as compared with control group [(34.04±1.74)%,P＜0.01].Cell suppression rate(21.18±5.92)%,(44.58±3.43)%and(70.15±2.90)%,respectively, in 20,40 and 60 μg·mL-1ellagic acid treatment groups.Compared with the control group,the differences were significant(P＜0.01).Cell apoptosis rate was(9.60±0.56)%,(19.30±1.51)%and(35.10±5.26)%,respectively,in 20,40 and 60 μg·mL-1ellagic acid treatment groups,with significant differences as compared with the control group[(3.23±0.85)%,P＜0.01].With the increase of drug concentration,COX-2 expression was decreased.ConclusionEllagic acid can inhibit myeloma SP2/0 cell proliferation and promote apoptosis.

Ellagic acid;Multiple myeloma;SP2/0 cell lines;Proliferation;Apoptosis

R965

A

1004-0781(2014)10-1321-05

2013-11-04

2014-02-12

趙寧(1987-),男,山東煙臺(tái)人,在讀碩士,從事脊柱骨病研究。電話:(0)13380901521,E-mail:1018644585@ qq.com。

嚴(yán)冬雪(1966-),男,副教授,碩士生導(dǎo)師,碩士,從事脊柱骨病研究。電話:(0)13517732038,E-mail:ydx562828@sina.com。