趙燕娜,楊力,郝春影,2,李艷紅,2,王向濤,郭一飛

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所,北京 100193;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

離子強度對甲氨蝶呤-樹枝狀大分子納米粒穩(wěn)定性的影響*

趙燕娜1,楊力1,郝春影1,2,李艷紅1,2,王向濤1,郭一飛1

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所,北京 100193;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

目的 研究離子強度對甲氨蝶呤-樹枝狀大分子納米粒穩(wěn)定性的影響。方法以粒徑及載藥量變化為主要指標(biāo),分別考察不同離子(Na+、Cl-)及不同濃度氯化鈉溶液對載藥納米粒穩(wěn)定性的影響。結(jié)果確定Cl-起到穩(wěn)定載藥納米粒的作用,且溶液中氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜1.80%時,對納米粒穩(wěn)定作用明顯。結(jié)論質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜1.80%的氯化鈉溶液使得載藥納米粒穩(wěn)定性明顯增加,有助于長期儲存。

甲氨蝶呤;離子強度;粒徑;納米粒;穩(wěn)定性

本課題組先前制備以四代的聚酰胺-胺(polyamidoamine,PAMAM)樹形分子為內(nèi)核,以50%耦聯(lián)效率接枝的二代三乙二醇樹枝化基元寡聚乙二醇[oligo(ethylene glycol),OEG]為外殼的樹枝狀大分子(PAMAM-co-0.5OEG,0.5PAG,見圖1),成功裝載MTX,形成具有較高載藥量和包封率的納米粒。由于0.5PAG的PAMAM表面有暴露的弱堿性的-NH2基團(tuán),而MTX本身帶有兩個酸性的-COOH基團(tuán),因而靜電相互作用是PAMAM裝載MTX形成納米粒的主要驅(qū)動力[15-17]。這也在其他實驗結(jié)果中也得以驗證。在對納米粒穩(wěn)定性的考察過程中,發(fā)現(xiàn)特定種類的鹽溶液能顯著影響其穩(wěn)定性。因此,筆者在本研究探討在藥物裝載及儲存過程中,不同離子(Na+、Cl-)的溶液對納米粒穩(wěn)定性的影響,以期提高納米粒長期儲存穩(wěn)定性。

圖1 0.5PAG結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of 0.5PAG

1 儀器與試藥

1.1 儀器 KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DGG-9030AD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司);MEPPLER TOLEDO AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];RJ-TGL-16C型高速臺式離心機(無錫市瑞江分析儀器有限公司);PURELAB Classic綜合純水儀(英國ELGA公司);LGL-10B冷凍干燥機(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗儀器廠研制,北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司制造);Zetasizer Nano ZS 90(馬爾文儀器有限公司);Ultimate 3000 Series高效液相色譜儀(Dionex); Hypersil GLOD C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm, Thermo Scientific,美國);離心過濾器(Millipore Amicon Ultra-0.5 mL,Ultracel-3K Membrane,美國)。

1.2 試藥 0.5PAG(相對分子質(zhì)量1.34×105,本實驗室合成);MTX(相對分子質(zhì)量454.44,上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司);乙腈(批號:A3889,Fisher,色譜純);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 MTX含量測定方法的建立

2.1.1 HPLC Hypersil GLOD C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm);流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS,pH=7.4)=(10∶90);流速0.8 mL·min-1;檢測波長306 nm;溫度30℃;進(jìn)樣量20 μL[4]。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 采用PBS溶液配制75,30, 10,5,1,0.4 μg·mL-1MTX溶液,在“2.1.1”項色譜條件下測定峰面積(A)。以A對濃度(C,μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸,得MTX標(biāo)準(zhǔn)曲線,A=0.209 6+1.351 3×C,r=0.999 9,MTX濃度在0.4～75.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 MTX-0.5PAG納米粒的制備及表征

2.2.1 不同介質(zhì)MTX-0.5PAG納米粒的制備及表征

室溫下,將聚合物0.5PAG 16 mg與MTX 8 mg共同溶解于N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide, DMF)1 mL中,攪拌3 h。隨后,在4℃條件下,加入去離子水(5 mL),室溫下繼續(xù)攪拌12 h,再于4℃條件下對去離子水透析4 h,1 L·h-1,即得以水為介質(zhì)MTX-0.5PAG納米粒。將上述步驟中的去離子水換成0.9%氯化鈉溶液,即得以0.9%氯化鈉溶液為介質(zhì)的MTX-0.5PAG納米粒。

以動態(tài)光散射測定不同介質(zhì)載藥納米粒粒徑及電位,測定結(jié)果以平均粒徑(D,nm)及Zeta電位(mV)記錄。同時,以HPLC測定其包封率(encapsulation efficiency,EE)及載藥量(drug loading capacity,DL)。方法如下:取納米粒1 mL,冷凍干燥后用PBS溶解并定容到5 mL,按照“2.1.1”項色譜條件HPLC進(jìn)樣20 μL測定MTX濃度,計算得出納米粒中MTX總量,記為W1。由于0.5PAG相對分子質(zhì)量較大,在納米粒對水透析過程中不會被透出,因而可以根據(jù)以下公式計算EE和DL:EE(%)=(W1/W2)×100%;DL(%)= [W1/(W1+W3)]×100%。其中,W1為納米粒中的MTX總量,W2為MTX投藥量,W3為0.5PAG投藥量。將水和0.9%氯化鈉溶液為介質(zhì)制備的MTX-0.5PAG納米粒進(jìn)行對比,結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,二者包封率和載藥量無明顯差別;但介質(zhì)為水時,納米粒的粒徑約為300 nm,0.9%氯化鈉溶液納米粒粒徑明顯減小,且其粒徑分布變窄(圖2)。

2.2.2 不同介質(zhì)MTX-0.5PAG納米粒的放置穩(wěn)定性 不同介質(zhì)制備的MTX-0.5PAG納米粒于4℃冰箱放置10 d,每天取樣,用動態(tài)光散射測定放置過程中的粒徑變化。結(jié)果見圖3。0.9%氯化鈉溶液為介質(zhì)的MTX-0.5PAG納米粒溶液放置10 d內(nèi)粒徑均穩(wěn)定在80～120 nm,放置2周沒有肉眼可見的變化,顯現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。而同樣條件下測定的,以水為介質(zhì)的納米粒在放置過程中隨著時間的延長,粒徑波動較大,且無特定規(guī)律,放置2周即出現(xiàn)明顯的黃色藥物沉淀,這種現(xiàn)象在其他實驗過程中同樣可以觀察到。分析其原因,可能是由于納米粒本身為不穩(wěn)定體系,粒徑測定結(jié)果也不穩(wěn)定。

表1 不同介質(zhì)制備的MTX-0.5PAG納米粒的表征Tab.1 Characterization of the MTX-0.5PAG nanoparticles prepared by different medium n=3,±s

表1 不同介質(zhì)制備的MTX-0.5PAG納米粒的表征Tab.1 Characterization of the MTX-0.5PAG nanoparticles prepared by different medium n=3,±s

Zeta電位/包封率載藥量112.05±0.68 0.9%氯化鈉溶液67.54±6.0525.23±1.69128.63±5.870.18±0.0 mV水70.20±3.9725.97±1.09301.27±4.860.48±0.0制備介質(zhì)%粒徑/ nm多分散指數(shù)1-0.81±0.20

圖2 不同介質(zhì)MTX-0.5PAG納米粒的粒徑Fig.2 ParticlediameteroftheMTX-0.5PAG nanoparticles in different medium

圖3 不同介質(zhì)MTX-0.5PAG納米粒放置過程中的粒徑變化(n=3)Fig.3 Changes of particle diameter of the MTX-0.5PAG nanoparticlesreconstitutedbydifferentmediumduring placement(n=3)

2.3 MTX-0.5PAG納米粒的凍干復(fù)溶穩(wěn)定性

2.3.1 MTX-0.5PAG納米粒凍干復(fù)溶后的粒徑變化MTX-0.5PAG納米粒(未特殊說明均指介質(zhì)為水的納米粒)1 mL,-80℃預(yù)凍1 h,迅速放入冷凍干燥機,凍干12 h,取出后加入一定體積去離子水或5%葡萄糖溶液或0.9%氯化鈉溶液,超聲溶解30 s,用動態(tài)光散射測定粒徑,并監(jiān)測其4℃放置過程中的粒徑變化。見圖4?？梢?用去離子水和5%葡萄糖溶液復(fù)溶的納米粒,在4℃條件下放置9 d,其粒徑均會隨時間發(fā)生較大程度的波動,且每個時間點的粒徑數(shù)據(jù)精密度較差。至第9天出現(xiàn)霧狀懸浮顆粒(振搖即消失),再放置2周,底部即出現(xiàn)大量不可逆的藥物粉末沉淀。而用0.9%氯化鈉溶液復(fù)溶的納米粒,其粒徑則在3 d內(nèi)趨于穩(wěn)定,3周內(nèi)均無明顯變化。以上進(jìn)一步證實0.9%氯化鈉溶液可能會對納米粒起到一定的穩(wěn)定作用。

圖4 MTX-0.5PAG納米粒不同溶劑復(fù)溶后放置過程中的粒徑變化(n=3)Fig.4 Changes of particle diameter of the MTX-0.5PAG nanoparticlesreconstitutedbydifferentmediumduring placement(n=3)

2.3.2 MTX-0.5PAG納米粒0.9%氯化鈉溶液復(fù)溶后放置過程中載藥量的變化 以0.9%氯化鈉溶液復(fù)溶的MTX-0.5PAG納米粒,按照下述方法測定復(fù)溶后4 d內(nèi)放置過程中載藥量的變化,與未經(jīng)凍干的納米粒相同放置條件下載藥量的變化進(jìn)行對比,以進(jìn)一步考察其凍干復(fù)溶穩(wěn)定性。MTX-0.5PAG納米粒溶液0.5 mL置于離心過濾器的內(nèi)襯管內(nèi)(底部有Ultracel超濾膜, MWCO 3000),56 000×g離心20 min,取濾液,HPLC進(jìn)樣測定。由于0.5PAG相對分子質(zhì)量遠(yuǎn)大于3 000,無法通過Ultracel超濾膜,因而,可認(rèn)為濾液中的MTX為納米粒溶液泄漏出來的游離藥物。通過測定濾液中的MTX濃度,計算得0.5 mL納米粒濾液中的MTX總量W2,已知0.5 mL納米粒溶液中MTX的總量W1(由包封率測定結(jié)果計算得出),及0.5 mL納米粒溶液中0.5PAG的量W3(由0.5PAG的投藥量計算得出),得出放置不同時間后納米粒的載藥量(DL)。DL(%)= (W1-W2)/(W1-W2+W3)×100%。結(jié)果見圖5。從圖5可以看出,用去離子水制備的納米粒,放置4 d載藥量下降近40%,說明納米粒并不穩(wěn)定,在放置過程中很快泄漏出大量游離藥物。凍干后用0.9%氯化鈉溶液復(fù)溶,放置4 d內(nèi)納米粒載藥量并無下降趨勢,且隨放置時間的延長,能顯著降低載藥量測定過程中,高速離心對納米粒的破壞。進(jìn)一步證實0.9%氯化鈉溶液對MTX-0.5PAG納米粒的穩(wěn)定作用。

圖5 MTX-0.5PAG納米粒放置及0.9%氯化鈉溶液復(fù)溶后放置過程中載藥量的變化(n=3)Fig.5 Changes of drug-loading rate of the MTX-0.5PAG nanoparticles or the ones reconstituted by saline during placement(n=3)

2.4 離子類型對MTX-0.5PAG納米粒的穩(wěn)定性影響為進(jìn)一步探究影響MTX-0.5PAG納米粒穩(wěn)定性的原因,考查不同離子(Na+和Cl-)環(huán)境中納米粒的穩(wěn)定性:將凍干后的MTX-0.5PAG納米粒分別分散于0.9%氯化鈉溶液、150 mmol·L-1的KCl(與0.9%氯化鈉溶液中Cl-摩爾濃度相等)及75 mmol·L-1Na2SO4(與0.9%氯化鈉溶液中Na+摩爾濃度相等)溶液中,超聲混勻,穩(wěn)定后進(jìn)行粒徑測定。然后于4℃冰箱放置,隔一定時間測粒徑,與未經(jīng)凍干的納米粒相同條件下放置的粒徑變化進(jìn)行對比。結(jié)果見圖6,可見,Cl-等摩爾量的NaCl和KCl,二者加入后納米粒粒徑變小,放置7 d,納米粒粒徑波動也并不大,證實二者均具有增加納米粒穩(wěn)定性的作用。而對比Na+等摩爾量的NaCl和Na2SO4,同樣條件下,加入NaCl后納米粒粒徑均變小,但加入Na2SO4納米粒粒徑變化卻并不大。這一結(jié)果表明,納米粒穩(wěn)定性的增加可能是由于體系中的Cl-的作用。

2.5 不同濃度NaCl對MTX-0.5PAG納米粒的穩(wěn)定性影響 為確定增加納米粒的穩(wěn)定性應(yīng)加入的NaCl的量,考察不同濃度NaCl對MTX-0.5PAG納米粒的穩(wěn)定性影響。向MTX-0.5PAG納米粒溶液中分別添加NaCl,使NaCl終濃度分別為0.01%、0.02%、0.10%、0.30%、0.90%、1.80%、3.60%,穩(wěn)定后進(jìn)行粒徑及電位測定。然后于4℃冰箱放置,10 d后再次進(jìn)行粒徑及電位測量。結(jié)果見表2。表2的粒徑測量結(jié)果顯示,在NaCl濃度≤1.80%時,納米粒粒徑穩(wěn)定在納米級別且粒徑分布呈現(xiàn)單峰分布,納米粒狀態(tài)良好。而NaCl濃度增大到3.60%時,納米粒粒徑突然增大到微米級別,粒徑分布峰變得較為雜亂,放置10 d后再次測量,其粒徑變化不大,但再放置約2周,加入NaCl濃度為3.60%的納米粒溶液能明顯看到有分層現(xiàn)象。

圖6 離子類型對MTX-0.5PAG納米粒粒徑的影響(n=3)Fig.6 Effect of different ions on particle diameter of the MTX-0.5PAG nanoparticles(n=3)

3 討論

由于納米粒的穩(wěn)定性與粒徑大小關(guān)系密切,隨著粒徑的降低,納米粒的穩(wěn)定性增加。因此在納米粒的制備過程中,將介質(zhì)水換成0.9%氯化鈉溶液,納米粒粒徑明顯減小,說明0.9%氯化鈉溶液可能會對納米粒起到一定的穩(wěn)定作用,這在納米粒的凍干復(fù)溶穩(wěn)定性實驗中也得到了進(jìn)一步的驗證。

表2 不同濃度NaCl對MTX-0.5PAG納米粒粒徑與電位的影響(n=3)Tab.2 Effect of different concentration of saline on particle diameter and electric potential of the MTX-0.5PAG nanoparticles(n=3) ±s

表2 不同濃度NaCl對MTX-0.5PAG納米粒粒徑與電位的影響(n=3)Tab.2 Effect of different concentration of saline on particle diameter and electric potential of the MTX-0.5PAG nanoparticles(n=3) ±s

NaCl濃度/%粒徑/nm Zeta電位/mV 0 d10 d 0 d10 d 0.01215.4±4.7190.4±1.56.0±0.26.3±0.3 0.02227.6±2.5204.5±1.24.1±0.44.3±0.4 0.10255.8±1.7221.6±0.32.5±0.72.4±0.6 0.30301.9±9.5259.0±3.4-0.2±0.3-0.1±0.1 0.90424.4±4.8315.5±6.8-2.1±0.2-1.6±0.2 1.80447.9±5.2360.9±6.9-2.7±0.4-2.2±0.6 3.602 585.0±221.3412.0±46.8-3.6±0.7-1.5±0.1

不同離子(Na+和Cl-)環(huán)境中納米粒的穩(wěn)定性實驗,證實納米粒穩(wěn)定性的增加可能是由于體系中的Cl-的作用。且通過不同濃度NaCl對MTX-0.5PAG納米粒的穩(wěn)定性影響實驗發(fā)現(xiàn),濃度＜1.80%的NaCl溶液,納米粒相對穩(wěn)定,NaCl濃度增高到一定程度,納米粒穩(wěn)定性反而降低。在NaCl濃度從低到高的變化過程中,納米粒的Zeta電位出現(xiàn)從正值到負(fù)值的轉(zhuǎn)變,但其電位值均未達(dá)到傳統(tǒng)納米粒電位的穩(wěn)定臨界值30 mV。推測這可能是由于實驗中所使用的0.5PAG本身親水性及電離性質(zhì)不同于傳統(tǒng)兩親性表面活性劑,載藥機制較為復(fù)雜,因而其為載體材料制備的納米粒無法根據(jù)電位值的變化進(jìn)行穩(wěn)定性的判斷。

本研究結(jié)果表明,質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜1.80%的NaCl使MTX-0.5PAG納米粒溶液穩(wěn)定性明顯增加,這為MTX-0.5PAG納米粒的長期儲存提供可能,有利于對納米粒進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)和生物利用度研究。

[1] 馬一平.抗腫瘤藥物的研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué),2001,13 (5):17-19.

[2] 鄭明彬,龔萍,楊雪梅,等.包載甲氨蝶呤的聚乙交酯丙交酯納米顆粒的制備與體外釋藥機制研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(11):2812-2813.

[3] 吳建鋒,於得紅,方超,等.甲氨蝶呤-聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米囊的制備及其體外釋藥的研究[J].中國藥學(xué)雜志,2010,45(2):119-123.

[4] 何花,盛小茜,張海龍,等.甲氨蝶呤柔性納米脂質(zhì)體的構(gòu)建及表征[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2012,43(10):827-831.

[5] 王璐璐,朱林,倪坤儀,等.HPLC研究甲氨喋呤磁靶向脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的組織分布[J].中國藥學(xué)雜志,2006, 41(20):1572-1575.

[6] 尹耀庭,何花,盛小茜,等.甲氨蝶呤柔性納米脂質(zhì)體凝膠的構(gòu)建及體外經(jīng)皮滲透性研究[J].中南藥學(xué),2012, 10(8):590-594.

[7] 郎軼詠,姜同英,鄭力,等.甲氨蝶呤/聚天冬氨酸衍生物-接枝-聚乙二醇共聚物膠束制備及其體內(nèi)外釋藥考察[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2010,30(5):396-399.

[8] 支曉慧,金莉莉,楊長青.甲氨蝶呤微乳的制備與質(zhì)量評價[J].中國藥房,2011,22(5):433-436.

[9] 孫宇,鈕萌萌,王佳苗,等.噴霧干燥法制備鼻用甲氨蝶呤殼聚糖微球及其特性的考察[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2009,26(4):260-264.

[10] 孔淑儀,唐國濤,裴元英,等.聚乙二醇修飾的聚酰胺-胺-甲氨蝶呤分子復(fù)合物的制備及體外釋藥研究[J].中國藥學(xué)雜志,2008,43(14):1085-1091.

[11] 林蘇娜,林華慶.納米粒作為抗腫瘤藥物載體的研究進(jìn)展[J].中國腫瘤臨床,2013,40(6):363-366.

[12] 章怡彬,梁文權(quán),高建青.納米粒作為抗腫瘤藥物載體的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2006,25(6):551-553.

[13] 陳莉,湯忞,陸偉根.納米混懸劑粒徑穩(wěn)定性及其控制策略[J].世界臨床藥物,2010,31(4):245-249.

[14] OWEN H,GRAHAM S,WERLING J O,et al.Anion effects on electrostaticchargingofstericallystabilized,water insoluble drug particles[J].Int J Pharm,2009,368(1-2): 154-159.

[15] TWYMAN L J,BEEZER A E,ESFAND R,et al.The synthesis of water soluble dendrimers,and their application as possible drug delivery systems[J].Tetrahedron Lett, 1999,40(9):1743-1746.

[16] KOLHE P,MISRA E,KANNAN R M,et al.Drug complexation,in vitrorelease and cellular entry of dendrimers and hyperbranched polymers[J].Int J Pharm,2003,259(1-2):143-160.

[17] KOJIMA C,KONO K,MARUYAMA K,et al.Synthesis of polyamidoamine dendrimers having poly(ethylene glycol) grafts and their ability to encapsulate anticancer drugs[J]. Bioconjug Chem,2000,11(6):910-917.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.030

Effect of Ionic Strength on Stability of Methotrexate-loaded Dendrimer Nanoparticles

ZHAO Yan-na1,YANG Li1,HAO Chun-ying1,2,LI Yan-hong1,2,WANG Xiang-tao1,GUO Yi-fei1
(1.The Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100193,China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

ObjectiveTo investigate the influence of ionic strength on the stability of the methotrexate-loaded dendrimer nanoparticles.MethodsThe influences of different ions(Na+,Cl-)and different concentrations of sodium chloride on the stability of the nanoparticles were studied.The particle size was measured by dynamic light scattering(DLS)and drugloading content was determined by high-performance liquid chromatography(HPLC)in order to evaluate the stability.ResultsThe Cl-was finally verified to play an important role in stabilizing the nanoparticles and the effective concentration of the sodium chloride was recommended to be below 1.80%.ConclusionThe recommended concentration(less than 1.80%)of the sodium chloride significantly improves the stability of the nanoparticles and benefits for long term storage.

Methotrexate;Ionic strength;Size;Nanoparticles;Stability

R979.1;R927.11

A

1004-0781(2014)10-1365-05

2013-11-12

2014-02-24

*國家自然科學(xué)基金資助項目(21004079)

趙燕娜(1990-),女,山東聊城人,碩士,主要從事藥物新型載體材料研究。電話:(0)18618328872,E-mail:zhaoyanna20102010@163.com。

郭一飛(1982-),女,河南鄭州人,助理研究員,博士,主要從事藥用高分子材料研究。電話:010-57833264,E-mail:ffguo@163.com。

楊力(1979-),男,河南信陽人,助理研究員,博士,主要從事納米材料制備及應(yīng)用研究。電話:010-62108290,E-mail:yangli6162@126.com。