張振軍

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部,承德 067000)

HPLC-UV-ELSD測定復(fù)方丹參滴丸中6種成分含量

張振軍

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部,承德 067000)

目的 同時(shí)測定復(fù)方丹參滴丸中丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量,為完善復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。方法采用HPLC-UV-ELSD法,Waters symmetry C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)色譜柱,流動(dòng)相為乙腈(A)∶0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0 min→10 min→15 min→30 min→50 min→60 min,A為10%→10%→20%→25%→60%→85%),流速1 mL·min-1,柱溫30℃,紫外檢測器參數(shù):檢測波長280 nm,蒸發(fā)光檢測器參數(shù):霧化管溫度36℃,漂移管溫度70℃,載氣壓強(qiáng)170 kPa。結(jié)果丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1依次在24.4～488.0 ng(r=0.999 5)、4.2～84.0 ng(r=0.999 4)、1.0～20.0 ng(r=0.999 3)、30.6～612.0 ng(r=0.999 4)、26.8～536.0 ng(r=0.999 5)、41.2～824.0 ng(r=0.999 5)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;平均回收率依次為98.58%(RSD=2.18%)、100.54%(RSD=1.98%)、100.55%(RSD=2.36%)、99.55%(RSD=1.59%)、99.43%(RSD=2.16%)、99.23%(RSD=2.49%)。結(jié)論該方法快速、準(zhǔn)確,無內(nèi)源物質(zhì)干擾,可為完善復(fù)方丹參滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

丹參滴丸,復(fù)方;檢測器,紫外;檢測器,蒸發(fā)光;色譜法,高效液相

復(fù)方丹參滴丸由丹參、三七、冰片組成,應(yīng)用現(xiàn)代制劑技術(shù)制成的新劑型,具有劑量小、服用方便、溶出速度快、起效迅速、可直接經(jīng)黏膜吸收、生物利用度高、療效高及無胃腸刺激、無明顯的毒副作用等特點(diǎn)[1-2]。其主要有效成分為丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1等,上述有效成分的測定方法目前主要采用高效液相色譜法(紫外檢測器)進(jìn)行測定[3-5]。由于三七中的皂苷類成分在采用紫外檢測器(UV)測定時(shí)受到干擾較多,不利于進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量分析。通過紫外檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)聯(lián)用,既能對(duì)復(fù)方丹參滴丸丹參中的主要成分進(jìn)行紫外檢測,也能對(duì)三七的主要成分進(jìn)行蒸發(fā)光檢測,有利于對(duì)復(fù)方丹參滴丸進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。同時(shí),結(jié)合中藥有效組分理論對(duì)復(fù)方丹參滴丸中與臨床療效相關(guān)的6種中藥有效組分進(jìn)行測定分析,為完善復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 丹參素鈉(批號(hào):110855-200806)、原兒茶醛(批號(hào):110810-200502)、丹參酮ⅡA(批號(hào):110736-200620)、三七皂苷R1(批號(hào):110745-200609)、人參皂苷Rg1(批號(hào):110703-201008)、人參皂苷Rg1(批號(hào): 110703-200316)、人參皂苷Rb1(批號(hào):110704-200314),供HPLC含量測定用,均由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。復(fù)方丹參滴丸由天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn),批號(hào):101001,101004,101006。

1.2 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀,2998 PDA檢測器及2424蒸發(fā)光散射檢測器,四元梯度泵,Empowers 3色譜工作站;KQ-100型超聲清洗器(昆明市超聲儀器有限公司);Sartorius BP211D分析天平(德國賽多利斯)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Waters symmetry C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)色譜柱,流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0 min→10 min→15 min→30 min→50 min→60 min,A為10%→10%→20%→25%→60%→85%),流速為1 mL·min-1,柱溫為30℃,紫外檢測器參數(shù):檢測波長為280 nm,蒸發(fā)光檢測器參數(shù):霧化管溫度36℃,漂移管溫度70℃,載氣壓力25 psi。理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算不低于2 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取丹參素鈉、原兒茶醛、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得到混合對(duì)照溶液(每毫升含丹參素12.2 μg、原兒茶醛2.1 μg、丹參酮ⅡA 0.5 μg、三七皂苷R115.3 μg、人參皂苷Rg113.4 μg、人參皂苷Rb120.6 μg)。

2.3 供試品溶液的制備 取本品100粒,研細(xì)成粉末(過三號(hào)篩),取約0.3 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,精密稱定,加熱回流1 h,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,用篩孔內(nèi)徑0.45 μm濾膜過濾,即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液,按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,分別以紫外檢測器和蒸發(fā)光檢測器檢測,結(jié)果見圖1,2。

圖1 對(duì)照品溶液(A)、供試品溶液(B)的高效液相色譜圖(UV檢測)

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2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取上述各對(duì)照品溶液2, 5,10,20,40 μL,注入色譜儀,丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA以進(jìn)樣量(μg)為自變量,色譜峰面積(A)為因變量,而三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1以進(jìn)樣量(μg)的對(duì)數(shù)為自變量,色譜峰面積(A)對(duì)數(shù)為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立回歸方程,見表1。可見該方法在較大范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取各對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次,并連續(xù)7 d進(jìn)樣,按丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA以峰面積,三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1以峰面積對(duì)數(shù)分別計(jì)算,結(jié)果顯示精密度符合要求,見表2。

圖2 對(duì)照品溶液(A)、供試品溶液(B)的高效液相色譜圖(ELSD檢測)

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表1 6種成分的回歸方程及線性范圍

表2 6種成分精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào):101001),按相應(yīng)的色譜條件,分別于配制后0,1,2,4,6,8,12,24 h進(jìn)樣,按照丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA以峰面積,三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1以峰面積對(duì)數(shù)分別計(jì)算,結(jié)果:各成分峰面積的RSD分別為1.93%, 1.56%,0.57%,2.69%,1.44%,1.93%。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品,共6份,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按相應(yīng)的色譜條件進(jìn)樣,按丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA以外標(biāo)一點(diǎn)法,三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1以對(duì)數(shù)外標(biāo)兩點(diǎn)法分別計(jì)算含量,丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的平均含量分別為11.31,1.53,0.06,2.11,2.16,3.89 mg·g-1,RSD分別為1.33%,0.79%,1.28%,2.59%,1.98%, 1.76%。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已經(jīng)確定含量的樣品(批號(hào):101001)6份,約0.25 g,精密稱定,精密加入對(duì)照品適量,按相應(yīng)的色譜條件進(jìn)樣,計(jì)算回收率,結(jié)果:丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的回收率分別為98.58%, 100.54%,100.55%,99.55%,99.43%,99.23%,RSD分別為2.18%,1.98%,2.36%,1.59%,2.16%, 2.49%。見表3。

2.10 含量測定 按照供試品制備方法對(duì)3批樣品處理,按照相應(yīng)的色譜條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算各成分的含量。結(jié)果見表4。

3 討論

采用反相高效液相色譜法,多指標(biāo)分析測定復(fù)方丹參滴丸與臨床療效相關(guān)的有效成分的含量,包括測定丹參的丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA,三七的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量,與選用單種或兩至三種成分作為中藥復(fù)方的質(zhì)量控制指標(biāo)相比較,更能夠全面地控制復(fù)方丹參滴丸的質(zhì)量。通過對(duì)方法考察,結(jié)果表明,所建立的檢測方法中,各成分精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好,加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果也符合規(guī)定,提示本方法可以用于復(fù)方丹參滴丸的質(zhì)量控制。

本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相系統(tǒng)的考察中,參考文獻(xiàn)[6-7]比較流動(dòng)相甲醇-水和乙腈-水,發(fā)現(xiàn)乙腈-水效果較為理想,另外復(fù)方丹參滴丸中的丹參素及原兒茶醛均屬于鄰二酚羥基結(jié)構(gòu),容易氧化導(dǎo)致含量測定不準(zhǔn)確,故在流動(dòng)相中加入0.1%磷酸溶液,目的是抑制丹參素及原兒茶醛的氧化。故筆者采用乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相,通過梯度洗脫,各組分能有效地分離,無干擾。本研究中6種有效成分均能達(dá)到基線分離,此測定方法能較好對(duì)丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1進(jìn)行定性和定量分析,系統(tǒng)適用性較好。

表3 6種成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 3批樣品中6種組分含量測定結(jié)果(n=3)

在復(fù)方丹參滴丸樣品制備中,由于采用甲醇溶液超聲提取時(shí),有效成分提取不夠充分,故改用甲醇回流提取。采用紫外檢測器和蒸發(fā)光檢測器聯(lián)合檢測,先通過紫外檢測器,設(shè)定吸收波長280 nm,對(duì)丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA進(jìn)行檢測,再通過蒸發(fā)光檢測器對(duì)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1進(jìn)行檢測,很多文獻(xiàn)對(duì)皂苷類的成分也用紫外檢測器檢測,設(shè)定波長約為203 nm,但是在這個(gè)范圍波長時(shí),圖譜容易出現(xiàn)一些干擾峰,通過蒸發(fā)光檢測器單獨(dú)對(duì)皂苷類的成分檢測,避免由于末端吸收而產(chǎn)生的干擾。另外,筆者通過紫外檢測器與蒸發(fā)光檢測器聯(lián)用,可以同時(shí)檢測復(fù)方丹參滴丸中的6種成分,操作簡單,檢測效率高,可為復(fù)方丹參滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和完善提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 官波,牛秀明.復(fù)方丹參滴丸作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2008,48(40):115-116.

[2] 向柏,潘振華,曹德英,等.復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量控制和藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國藥房,2007,18(9):708-710.

[3] 袁琦,趙輝.HPLC法測定復(fù)方丹參滴丸中丹參素的含量[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2008,27(2):31-33.

[4] 許勇,諸艷蓉,王柯,等.HPLC測定復(fù)方丹參膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(6):148-151.

[5] 汪紅,王強(qiáng).HPLC法測定復(fù)方丹參制劑中丹參有效成分的含量[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,33(3):219-221.

[6] 游燕,徐國良,張啟云,等.RP-HPLC同時(shí)測定復(fù)方丹參片中多種有效成分的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010, 16(18):50-53.

[7] 陸繼偉,于建,王柯,等.復(fù)方丹參片中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Re、Rb1的HPLC法測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2012,43(12):1027-1030.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.033

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)10-1375-05

2013-08-28

2013-10-22

張振軍(1964-),男,河北承德人,副主任藥師,學(xué)士,研究方向:中藥臨床合理用藥。電話:(0)13831446898, E-mail:cxqdzhangzhenjun@163.com。