郭潤正，吳春江，張艷，黃啟慧，李海峽，王勖，曹仲厚，毛育華，沈杰

(1.交通部長江航務(wù)管理局疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生檢驗所，武漢 430019；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所教育部重點實驗室，武漢 430030)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大鼠血漿紫檀芪濃度*

郭潤正1，吳春江1，張艷1，黃啟慧1，李海峽1，王勖1，曹仲厚1，毛育華2，沈杰2

(1.交通部長江航務(wù)管理局疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生檢驗所，武漢 430019；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所教育部重點實驗室，武漢 430030)

目的 建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測定大鼠血漿紫檀芪濃度。方法血漿樣品經(jīng)乙醚液液萃取處理。分析柱為Thermo Hypsil Gold色譜柱(2.1 mm×50 mm,5.0μm),保護柱為Thermo C18柱(4 mm×3.0 mm, 10.0μm),以乙腈-水(含1 mmol·L-1甲酸銨)為流動相梯度洗脫,流速為0.3 mL·min-1,進樣量10μL,內(nèi)標(biāo)為白藜蘆醇,采用電噴霧離子源(ESI),以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測。用于定量紫檀芪和內(nèi)標(biāo)的MRM掃描離子通道分別為m/z255.1→240.2,227.1→143.0。每個樣品的分析時間為5 min。結(jié)果紫檀芪和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為2.07, 1.90 min。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對測定無干擾,紫檀芪的線性范圍為1～100 ng·mL-1,日內(nèi)、日間精密度(RSD)均<15%;血漿低、中、高3種濃度(3,50,80 ng·mL-1)紫檀芪苷的準(zhǔn)確度分別為103.10%,98.12%和93.23%;血漿低、中、高3種濃度(3,50,80 ng·mL-1)紫檀芪的萃取回收率分別為78.6%,80.3%和83.2%;檢測方法不受基質(zhì)效應(yīng)影響。結(jié)論該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速,測定結(jié)果可靠,可用于紫檀芪的藥動學(xué)研究。

紫檀芪；色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,高效液相；血漿濃度

紫檀芪(pterostilbene)是廣泛存在于多種小漿果和紅酒中的芪類化合物。與同類白藜蘆醇(resveratrol)比較,其苯環(huán)上3,5的甲氧基取代了羥基。藥理學(xué)研究表明,甲基化的芪類化合物比羥基化的芪類化合物具有更高的生物活性,紫檀芪的多種生物活性優(yōu)于或至少不低于白藜蘆醇。近年研究顯示,紫檀芪除具有降血脂［1-2］、降血糖［3］、預(yù)防氧化應(yīng)激反應(yīng)［4-5］、抗炎［6］、抗真菌［7］、抗輻射［8］等作用,還能顯著抑制多種腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［9-11］。紫檀芪的研究展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。

關(guān)于紫檀芪的分析方法國內(nèi)外研究較少［12-14］,尤其紫檀芪在生物樣品中濃度的檢測方法,筆者尚未見報道。本實驗旨在應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LCMS/MS)檢測技術(shù),建立一種樣品處理簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的大鼠血漿紫檀芪的定量分析方法,以滿足紫檀芪生物樣本分析的需求。

1 材料與儀器

1.1 儀器 LC-20A型高效液相色譜系統(tǒng):DGU-20A3脫氣機、LC-20AT溶劑輸送泵、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器(美國Aglient公司)。AB SCIEX API 4000型三重四級桿質(zhì)譜儀,配備電噴霧離子源(Turbo Ionspray)、Analyst1.5分析軟件(美國Applied Biosystems公司)。VXW-80A型漩渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；MD 200 Sample concentrator型氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)；ALC 4239R型高速大容量臺式離心機；DL-5型微型高速離心機(北京儀誠科技公司)；KH-600E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；BS 124S電子天平(德國Sartorius公司)。

1.2 試藥 紫檀芪、白藜蘆醇對照品(純度99.5%,避光保存)購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇、乙醚、甲酸氨均為色譜純(美國Fisher Scientific公司,色譜純)；其他試劑均為市售分析純；水為樂百氏純凈水。

1.3 動物 普通級SD大鼠,購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心［單位許可證號:SCXK(鄂) 2008-0005,動物質(zhì)量合格證號NO.4200600335］,常規(guī)飼養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Thermo Hypsil Gold色譜柱(2.1 mm×50 mm,5.0μm)；保護柱:Thermo C18柱(4 mm×3.0 mm,10.0μm),柱溫30℃；流動相:A:水(含1 mmol·L-1甲酸銨),B:乙腈(含1 mmol·L-1甲酸銨),梯度條件:0～0.2 min,5%B；0.2～1.5 min, 5%B→95%B；1.5～2.5 min,2.5～2.6 min,95%B→5%B；2.6～5.0 min,5%B；流速:300μL·min-1；進樣量:10μL。每個樣品的分析時間:5 min。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,負離子掃描；噴霧口位置:3:5；Gas 1:0.27 MPa,Gas 2:0.35 MPa；氣簾氣壓:0.20 MPa；碰撞氣壓力:Medium；離子源電壓: -5 000.0 V,離子源溫度:500℃；駐留時間:200 ms；多重反應(yīng)監(jiān)測掃描分析；紫檀芪和白藜蘆醇的解簇電壓分別為:-100和-120 V；碰撞電壓分別為:-35和-30 V；用于定量紫檀芪和白藜蘆醇的多重反應(yīng)監(jiān)測掃描離子通道分別為m/z255.1→240.2,227.1→143.0。

2.3 溶液的配制

2.3.1 紫檀芪標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取紫檀芪對照品適量,置棕色量瓶中,用甲醇-水(50∶50)溶解并定容,配制成濃度為100μg·mL-1的儲備液I。將儲備液I用流動相稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液供分析用。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液 準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)白藜蘆醇對照品適量,用甲醇-水(50∶50)溶解并定容,配成濃度為100μg·mL-1的儲備液Ⅱ,并從中取出少量用流動相稀釋并定容,配成濃度為100 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。將以上所有溶液置于4℃冰箱內(nèi)貯藏,備用。

2.4 樣品預(yù)處理 取空白大鼠血漿樣品200μL,置于10.0 mL塑料離心管中,加入100 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液20μL,渦旋混勻3 min,然后加入乙醚3.0 m L,渦旋混勻5 min,4 000 r·min-1離心5 min,取上層有機相在40℃氮氣吹干,加入流動相200μL復(fù)溶,渦旋混勻3 min,12 000 r·min-1離心5 min后,取上清液10μL進樣分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 特異性 取空白血漿、空白血漿加標(biāo)準(zhǔn)品溶液加內(nèi)標(biāo)溶液樣品按“2.4”項下方法依次操作,照“2.1”及“2.2”項下色譜及質(zhì)譜條件進樣分析,考察6個來自不同個體的質(zhì)譜圖,結(jié)果表明,紫檀芪和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為2.07,1.90 min,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定,色譜圖見圖1,2。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取空白血漿200μL,分別加入不同濃度的紫檀芪工作溶液20μL,使血漿中紫檀芪的濃度分別為1,5,10,20,50,100 ng·mL-1,所有樣品按“2.4”項下方法操作,記錄色譜。以紫檀芪與內(nèi)標(biāo)峰面積比(Y)對紫檀芪濃度(X)進行線性回歸,得到典型回歸方程Y=0.010 1+0.059 9X(r= 0.996 9),權(quán)重因子W=1/χ2。結(jié)果表明,紫檀芪血漿濃度在1～100 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,最低定量限為1 ng·mL-1。

2.5.3 精密度及準(zhǔn)確度實驗 分別配制濃度為3, 50,80 ng·mL-1的血漿樣本各5份,按“2.4”項下方法處理樣品,進樣分析,考察紫檀芪日內(nèi)精密度及方法回收率；連續(xù)測定3 d,考察日間精密度。精密度及準(zhǔn)確度實驗結(jié)果見表1。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率的考察 精密吸取空白血漿200μL于離心管內(nèi),按“2.4”項下方法處理樣品,氮氣吹干后,分別用濃度為3,50,80 ng·m L-1的紫檀芪標(biāo)準(zhǔn)溶液200μL復(fù)溶,每個濃度配制5份樣品,取5μL進樣分析,得到色譜峰面積A與同樣濃度紫檀芪標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進樣獲得的色譜峰面積B的比值,考察基質(zhì)效應(yīng)。另分別配制濃度為3,50,80 ng·mL-1的血漿樣品各5份,按“2.4”項下方法處理樣品,進樣分析得到血漿樣品中紫檀芪的峰面積C,C/A×100%即為提取回收率。結(jié)果表明,紫檀芪低、中、高3種濃度的基質(zhì)影響百分比(n=5)分別為100.98%, 102.39%,94.29%,相應(yīng)的RSD分別為13.65%, 10.18%,8.13%。可見,該方法基質(zhì)效應(yīng)小,具有特異性和專一性。紫檀芪低、中、高3濃度提取回收率分別為78.6%,80.3%和83.2%,相應(yīng)的RSD分別為8.08%,5.17%,7.85%。

圖1 空白血漿和紫檀芪的HPLC-MS/MS圖A.空白血漿;B.空白血漿+紫檀芪(10 ng·m L-1);1.紫檀芪Fig.1 HPLC-MS/MS ch romatogram s of pterostilbene and blank plasmaA.blank plasma;B.blank plasma spiked with pterostilbene (10 ng·mL-1);1.pterostilbene

表1 紫檀芪含量測定的精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果Tab.1 Precision and accuracy of the content determ ination of pterostilbene n=5,%

圖2 空白血漿和內(nèi)標(biāo)白藜蘆醇的HPLC-MS/MS圖A.空白血漿;B.空白血漿+內(nèi)標(biāo)白藜蘆醇(10 ng·m L-1); 1.白藜蘆醇Fig.2 HPLC-MS/M S ch romatogram s of as blank plasma and resveratrol internal standardA.blank plasma;B.blank plasma plus resveratrol (10 ng·mL-1);1.resveratrol

2.5.5 樣品穩(wěn)定性考察 配制濃度分別為3,50, 80 ng·mL-1的血漿樣品若干,萃取處理前在室溫下放置24 h,萃取處理后在自動進樣器放置24 h,室溫→-80℃凍融3個循環(huán),-80℃保存1個月,按“2.4”項下方法處理,進樣分析,當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線,考察樣品穩(wěn)定性。樣品穩(wěn)定性結(jié)果表明,低、中、高血漿樣品在以上4種儲存條件下紫檀芪的濃度見表2。由表2可知,紫檀芪在上述保存條件下均是穩(wěn)定的。

3 討論

本實驗建立了一種樣品處理簡便、準(zhǔn)確、精密的測定大鼠血漿中紫檀芪濃度的LC-MS/MS方法。在方法摸索中,血漿樣本處理條件對比了沉淀蛋白法與液液萃取法。本研究中之初,采用甲醇和乙腈沉淀蛋白法處理樣本時,質(zhì)譜響應(yīng)值均有不同程度降低,分析原因可能是沉淀法處理血漿樣本,不能徹底去除內(nèi)源性物質(zhì),紫檀芪與內(nèi)源性物質(zhì)在LC-MS接口處競爭性地與初級離子反應(yīng),降低待測物離子的生成效率,進而使其響應(yīng)值偏低。采用乙醚為有機溶劑進行血漿樣品萃取,紫檀芪提取回收率接近80%,且各個濃度非常接近。

表2 紫檀芪穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab.2 Determination result of stability of pterostilbene ng·mL-1,±s,n=3

表2 紫檀芪穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab.2 Determination result of stability of pterostilbene ng·mL-1,±s,n=3

儲存條件加入量3 50 80室溫24 h 3.12±0.24 48.25±2.13 81.26±3.80萃取后自動進樣器24 h 3.18±0.17 49.48±1.38 83.24±2.79室溫→-80℃凍融3個循環(huán)3.04±0.27 50.07±2.11 79.45±3.18 -80℃保存1個月3.03±0.25 50.44±2.13 75.37±4.51

由于LC-MS/MS法的高特異性,分析工作者一度認(rèn)為色譜分離對于質(zhì)譜檢測的重要性下降了,但越來越多的事實表明,生物樣本分析中不能實現(xiàn)良好分離時,內(nèi)源性物質(zhì)雖然看不見,卻仍然對色譜后共流出組分的響應(yīng)值產(chǎn)生或強或弱的影響。因此,目前對基質(zhì)效應(yīng)的考察已成為LC-MS/MS法分析生物樣本時的重要內(nèi)容。本研究中之初,筆者采用甲醇和乙腈蛋白沉淀法,絕對基質(zhì)效應(yīng)超出85%～115%范圍,使測定結(jié)果偏差較大。使用液液萃取的方法將樣本處理得較為干凈,并配以較為充分的色譜分離時,基質(zhì)效應(yīng)得以消除。

總之,本實驗所建立的測定血漿中紫檀芪的LCMS/MS法,預(yù)處理簡單,分析時間適中,適于紫檀芪的生物樣本分析。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.008

Determination of Pterostilbene in Rat Plasma by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GUO Run-zheng1,WU Chun-jiang1,ZHANG Yan1,HUANG Qi-hui1,LIHai-xia1,WANG Xu1,CAO Zhonghou1,MAO Yu-hua2,SHEN Jie2
(1.CDC of Changjiang River Administration and Navigational Affairs,General Hospital of the Yangtze River Shipping,Wuhan 430019,China;2.Ministry of Education Key Laboratory of Environment and Health,School of Public Health,TongjiMedical College,Huazhong University ofScience and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)method for determination of pterostilbene in rat plasma.MethodsThe plasma samples were extracted with ethyl ether and then separated on Thermo Hypersil Gold column(2.1 mm×50 mm,5.0μm),and guarded by a Thermo C18column(4 mm×3.0 mm, 10.0μm).Themobile phase consisted of acetonitrile-water(containing 1 mmol·L-1ammonium formate)as gradient elution, and the flow rate was 0.3 mL·min-1.The injection volume was 10μL and resveratrol was used as the internal standard(IS). Electrospray ionization(ESI)source was applied and operated in a negativemode usingmultiple reaction monitoring(MRM). Pterostilbene and trans-resveratrol were detected on MRM by transition from the precursor to production(m/z255.1→240.2 and 227.1→143.0).The total run time was 5 min.ResultsThe retention time of pterostilbene and resveratrol was 2.07 and 1.90min,respectively.No endogenous interfering peaks were observed.The linearity was obtained within the range of 1-100 ng·mL-1.The precision(RSD)of inter-and intra-day was less than 15%and the accuracy was 103.1%,98.12%and 93.23%at low,mid,and high concentrations(3,50,80 ng·mL-1),respectively.The extraction recovery of pterostilbene was 78.6%,80.3%and 83.2%,respectively,and nomatrix effectwas observed.ConclusionThemethod is simple,sensitive, accurate and reliable,which is suitable for pharmacokinetics study of pterostilbene.

Pterostilbene;Chromatography-tandem mass spectrometry,high performance liquid;Plasma concentration

R282.71;R965

A

1004-0781(2014)01-0027-04

2013-01-07

2013-06-17

*國家自然科學(xué)基金資助項目(21177046)

郭潤正(1957-),男,浙江寧波人,高級工程師,碩士,研究方向:衛(wèi)生檢驗。電話：(0)15342601717,E-mail：guorunzheng2013@163.com。