何繼軍,楊亞民,馬維民,尚佑軍,呂 律,鄭海學(xué),靳 野,郭建宏,劉在新,劉湘濤
(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730046)
口蹄疫(Foot and Mouth Disease,F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,F(xiàn)MDV)引起偶蹄動物急性、熱性、高度接觸傳染性的傳染病,以其發(fā)病急、傳播迅速、發(fā)病率高、宿主譜系廣、危害大而倍受世界各國重視,國際動物衛(wèi)生組織(Off i ce International des Epizooties,OIE)將其列為法定報告動物疫病。FMDV屬小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus),有 O、A、C、Asia1和 SAT1、SAT2、SAT3等7個血清型[1]。血清型間無交叉免疫現(xiàn)象,即使在同一血清型內(nèi)不同病毒的抗原性也有變化[2-3],這為口蹄疫的防制帶來一系列復(fù)雜的問題。OIE/FAO世界口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室(OIE/FAO World Reference Laboratory for Foot and Mouth Disease,WRLFMD)對全球口蹄疫分子流行病學(xué)研究,將O型口蹄疫病毒株分為不同的拓?fù)湫停粗袊诺湫停–ATHAY)、中東-南亞型(Middle East-South Asia,ME-SA)、 東南亞型(South-East Asia,SEA)、印度尼西亞型(Indonesia,ISA)、東非型(East Africa,EA)、西非型(West Africa,WA)、 歐洲-南美型(Europe-South America,EURO-SA)[4-5]。根據(jù)國口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室流行病學(xué)研究資料,我國目前主要流行東南亞 型(SEA)、 中東-南亞型(ME-SA)等2個拓?fù)湫投局?。尤其以SEA拓?fù)湫拖翸ya-98毒株引起的疫情最為嚴(yán)重。
2010年年初,廣東省廣州市白云區(qū)一豬場發(fā)生由Mya-98毒株引起的口蹄疫疫情,隨之撲殺了大量的染疫動物和同群畜,經(jīng)濟(jì)損失巨大,我國及時向OIE報告了該起疫情。隨后,我國大面積暴發(fā)由該毒株引起的疫情,發(fā)病動物有豬、牛、羊等,疫情形勢十分嚴(yán)峻。與此同時,日本、韓國、朝鮮、蒙古、俄羅斯和中國香港、臺灣等國家和地區(qū)也報告發(fā)生由該毒株引起的疫情[6-9]。在此背景下,本研究系統(tǒng)地搜集和整理了我國2010年至2013年年底O型Mya-98毒株,明確了Mya-98毒株在我國的分布與流行情況,同時與世界口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室(WRL)、GeneBank等序列數(shù)據(jù)一起分析了我國Mya-98毒株與周邊國家毒株的遺傳關(guān)系,查明了我國Mya-98毒株的來源和主要易感動物,為今后針對性地防控該毒株提供了科學(xué)依據(jù)。
1.1.1 病料和毒株
采集或收集自我國2010年至2013年口蹄疫疑似病料共25份,來源于廣東省、甘肅省、山西省、江西省、貴州省、寧夏自治區(qū)、新疆自治區(qū)、西藏自治區(qū)、青海省、湖北省、遼寧省、江蘇省和四川省等13個省市區(qū)。病料通過接種敏感細(xì)胞或乳鼠傳代分離病毒。病毒培養(yǎng)物均由國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)保存。病料清單詳見表1,來源地域分布參見圖1。
表1 2010—2013年我國O型Mya-98毒株信息
1.1.2 口蹄疫抗原定型ELISA試劑盒
A、O、Asia1型口蹄疫抗原定型ELISA試劑盒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。
1.1.3 工具酶及試劑盒
總RNA提取試劑盒RNeasy mini Spin-Columns Kit購自德國QIAGEN公司;DNA膠純化回收試劑盒、DNA Marker、One step RT-PCR kit等購自Takara公司。
圖1 我國2010-2013年Mya-98毒株分布及區(qū)域流行圖示
1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)參考毒株序列
本研究所用中國國內(nèi)參考毒株序列由國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室(CNFMDRL)提供,中國香港、中國臺灣及世界其它國家毒株序列來自Genbank或CNFMDRL。參考毒株來源背景見表2。
表2 口蹄疫O型病毒株參考毒株
O-LAO-7-2003 老撾 2003EU667448 O-HLJOC12-03 中國 2003DQ119643 O-MOG-2004 蒙古 2004 JQ070324 O-TAI-8-2004 泰國 2004 HQ116233 O-TAI-10-2005 泰國 2005HQ116239 O-TAI-8-2005 泰國 2005 HQ116237 O-VIT-4-2005 越南 2005 HQ116278 O-MYA-2-2006 緬甸 2006HQ116225 O-MYA-1-2006 緬甸 2006JQ070316 O-LAO-4-2007 老撾 2007HQ116178 O-TAI-14-2007 泰國 2007HQ116249 O-TAI-2-2008 泰國 2008 HQ116250 O-MYA-6-2009 緬甸 2009HQ116229 O-TAI-22-2009 泰國 2009HQ116269 O-KOR-1-2010 朝鮮 2010HM143846 O-RUS-Jul-2010 俄羅斯 2010 JQ070329 O-SKR-4-2010 韓國 2010JQ070320 O-SKR-5-2010 韓國 2010JQ070321 O-SKR-12-2010 韓國 2010KC438373 O-MYA-3-2010 緬甸 2010JQ070319 O-JPN-1-2010 日本 2010 KF112885 O-HKN-7-2010 香港 2010JQ070303 O-VITYenBai-06-B 越南 2006 CNFMDRL O-VITHaiphong-06-S 越南 2006 CNFMDRL O-VITLangSon-06-Buff l o 越南 2006 CNFMDRL O-VN-YB08-2010 越南 2010 HQ260718 O-VN-YB09-2010 越南 2010 HQ260719 O-VN-YB10-2010 越南 2010 HQ260720 O-DY-CHA-2010 中國 2010 HQ652078 O-NC-CHA-2010 中國 2010 HQ652080 O-MY-CHA-2010 中國 2010 HQ652079 O-TZ-CHA-2010 中國 2010 HQ652081
1.1.5 引物
FMDV VP1基因擴(kuò)增用引物為1D2和1D5,VP1基因目的片段大小約810bp。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
1.2.1 病料處理
將待檢病料(水泡皮、水泡液)用pH 7.40.1mol-L 磷酸緩沖液(PB)洗滌2~3次,用滅菌的濾紙吸去水分,加入石英砂及適量青霉素和鏈霉素充分研磨1:5懸液,置于4℃過夜浸毒,3000 r-m離心10 min,上清即為待檢抗原。取上清液進(jìn)行病毒分離、血清型鑒定和核酸抽提。
1.2.2 病毒的血清型鑒定
用口蹄疫病毒抗原定型ELISA試劑盒對病料或鼠毒進(jìn)行血清型鑒定。按照試劑盒說明書操作。
1.2.3 口蹄疫病毒VP1基因RT-PCR擴(kuò)增
1.2.3.1 口蹄疫病毒RNA的提取
將預(yù)處理好的病料(或病毒培養(yǎng)物),5000r-min離心2min,取上清液用于病毒RNA的提取。用QIAGEN公司RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA的提取。
1.2.3.2 VP1基因的RT-PCR擴(kuò)增
應(yīng)用一步法RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。以50μL反應(yīng)體系為例,在250μL的PCR薄壁管中,加入10×One Step RNA PCR Buffer 5μL,dNTP(10mM)5μL,MgCl2(25mM) 10μL,RNase 抑 制 劑1μL(40U-μL),反轉(zhuǎn)錄酶(AMV) 1μL(5U-μL),RT-PCR聚合酶 1μL(5U-μL),正向引物1D21μL(50 pmol-μL),反向引物1D51μL(50 pmol-μL),RNA模板 25μL。混勻各反應(yīng)組份,置于熱循環(huán)儀中,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?2℃ 30 min,95℃ 2 min,95℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 8 min,30 個循環(huán)。
1.2.3.3 PCR產(chǎn)物檢測
PCR擴(kuò)增結(jié)束后,取5μL產(chǎn)物在1.5% TAE瓊脂糖凝膠中電泳,凝膠中含有0.5μL-mL的溴化乙錠,電泳緩沖液為1×TAE,80V~100V,15min~20min后于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。
1.2.4 PCR產(chǎn)物的純化、回收
用寶生物工程(大連)有限公司Agarose Gel DNA Purif i cation Kit回收DNA。操作按照說明書進(jìn)行。
1.2.5 PCR純化產(chǎn)物的測序
純化后的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序。測序引物與擴(kuò)增引物一致。
1.2.6 序列分析
用DNAstar(v 6.0)軟件對序列進(jìn)行分析與序列比對,應(yīng)用Treeview(v 1.6.6)進(jìn)行基因樹作圖。
本研究收集的25份疑似口蹄疫均分離到口蹄疫病毒,用抗原定型ELISA試劑盒鑒定均為口蹄疫病毒O型。
以特異性引物1D2、1D5進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,獲得約810 bp的含有VP1基因全長目的條帶。其大小均與預(yù)期的結(jié)果相符,見圖2。
圖2 VP1基因RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果
2.3.1 序列測定與比較
測序結(jié)果表明,我國豬口蹄疫O型病毒株的VP1 基因全長均為639bp,編碼213個氨基酸,未發(fā)現(xiàn)核苷酸的缺失或插入。按WRL建立的分子流行病學(xué)分析方法,對25條毒株序列進(jìn)行基因型分析,結(jié)果這些毒株均屬于SEA拓?fù)湫停▓D2)。我國Mya-98流行株VP1基因序列同源性在95%~100%之間。
以我國2010年廣東省廣州市白云區(qū)毒株(O-GDgzh-2010-S-31)為代表,其與中國香港、日本、韓國等(2010年)毒株同源性在99%左右,屬高度同源;與越南等東南亞國家(2010年)毒株同源性98.4%以上,而與我國非官方歷史Mya-98毒株(O-HLJOC12-03)同源性僅94.1%。
由此可見,我國2010年開始流行的Mya-98毒株,屬從東南亞國家傳入我國。該結(jié)果與WRL分析結(jié)果一致。
2.3.2 Mya-98毒株進(jìn)化分析
結(jié)合WRL、國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室歷年Mya-98毒株序列,Mya-98毒可分為3個遺傳組別(Group):
組別1(G1),見于越南(1997)、緬甸(1998)、柬埔寨(1998)等國家。發(fā)病動物主要為牛。該組別毒株可能為SEA拓?fù)湫投局甑脑搭^,在后來未見相關(guān)流行報道。
組別2(G2),包括東南亞國家(如越南、老撾、緬甸、馬來西亞等2001~2008年毒株)的毒株。發(fā)病動物主要為牛,也可見豬發(fā)病,如越南毒株(O-VITHaiphong-06-S)。從WRL分子流行病學(xué)報告中發(fā)現(xiàn),該組毒株在俄羅斯、蒙古等2010年也見有引起疫情的報道。疑惑的是,我國大陸未見由該組毒株引發(fā)的疫情報告。東南亞特有的毒株如何跨越我國大陸,在蒙古和俄羅斯等國家流行,也是備受關(guān)注的話題之一。
組別3(G3),包括我國、東南亞國家及我國周邊日本、韓國、俄羅斯、蒙古等Mya-98毒株。根據(jù)流行年代不同,又可以分為兩個不同的進(jìn)化分支(G3A和G3B)。G3A主要是2003~2005年流行毒株,如中國O-HLJOC12-03毒株,蒙古O-MOG-2004、越南O-VIT-4-2005等毒株。G3B包括我國2010年以后流行的全部毒株。G3組內(nèi)毒株同源性94%左右,分支內(nèi)毒株同源性98%以上。參見圖3。該組毒株可引起豬、牛、羊等家畜發(fā)病,宿主范圍極其廣泛。
G1與G2毒株同源性84%左右,G1與G3毒株同源性84%左右,G2與G3毒株同源性89%左右,其間最大可達(dá)到15%以上的差異,表明該毒株變異速度之快。這點(diǎn)或許是Mya-98毒株在東南亞長期流行,難以控制的原因之一。
另外,比較不同組別的Mya-98毒株發(fā)現(xiàn),Mya-98(G3B)在VP1基因上,第47位氨基酸P-Q→S,58位S-A→P,138位E→G和198位E→A的替換,142位L→P的零星變異等等,體現(xiàn)了其共同變異特征或趨勢。雖然,關(guān)乎抗原位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸并沒有改變,但其變異位置已經(jīng)觸及關(guān)鍵位點(diǎn)或區(qū)域,或可代表了該毒株進(jìn)化的方向。
口蹄疫M(jìn)ya-98毒株在遺傳關(guān)系上分屬于O型SEA拓?fù)湫?,因?998年前后主要在緬甸等東南亞國家流行,因此命名為Mya-98毒株。與之同屬一個拓?fù)湫偷倪€有Cam-94毒株(柬埔寨94)。Cam-94毒株主要限制在東南亞國家如柬埔寨(1994,1998)、老撾(1998)、越南(1997,1999)、馬來西亞(2001-2003)等國家流行[10-12],近來未見由該毒株引起的疫情,我國歷史上也從未監(jiān)測到Cam-94毒株。
通過本研究表明,Mya-98毒株在東南亞等國家長期流行,于2010年前后傳入我國。但遺憾的是,由于缺少詳細(xì)的流行病學(xué)背景資料,該毒株以何路徑、以何種方式傳入我國不得而知。本文僅根據(jù)VP1基因序列分析和比較[4,13-15],推測了我國Mya-98毒株的來源。東南亞越南、老撾、緬甸與我國接壤,邊境地區(qū)移動、動物及產(chǎn)品貿(mào)易頻繁,這些國家口蹄疫疫情傳入我國的風(fēng)險極高。而且,在東南亞國家常見由于動物移動或貿(mào)易引發(fā)的疫情[16],這種跨區(qū)域的流行和傳播,也催生了東南亞-中國口蹄疫控制行動計劃(SEACFMD)的出臺。近年來,在全球范圍內(nèi)也常見毒株跨區(qū)域傳播流行的例子,如2011年中東地區(qū)O型PanAsia-2毒株在歐洲國家保加利亞引發(fā)疫情[17];2012年SAT2型在北非埃及、利比亞等國家強(qiáng)勢流行[18],甚至在亞洲如巴勒斯坦等也監(jiān)測到SAT2型毒株;2013年9月南亞Ind-2001毒株在北非利比亞等國家引發(fā)疫情。因此,如何防堵境外毒株的傳入,是我國口蹄疫防控工作面臨的一個新課題,或者說如何控制流行毒株的跨區(qū)域傳播,是今后口蹄疫防控面臨的共同難題。在我國,與之相似的情況還有2009年A型Sea-97毒株、2011年新泛亞毒株和2013年A型Sea-97 G2毒株?;仡櫸覈鼇淼目谔阋吡餍袣v史,幾乎造成大流行的毒株均來自于境外,我國防堵境外口蹄疫流行毒株的任務(wù)越來越重要。
另外,Mya-98毒株宿主適應(yīng)和轉(zhuǎn)向值得關(guān)注。2010年,我國Mya-98毒株在豬、牛、羊等均可引起發(fā)病。之后,我國再未見由該毒株引起牛發(fā)病的報道,宿主范圍表面上在縮小,但實(shí)則引發(fā)了更為嚴(yán)重的后續(xù)效應(yīng),即豬Mya-98疫情的持續(xù)和該毒株將來在豬群中的維持和常態(tài)化。分析我國口蹄疫流行毒株與易感動物的關(guān)系可以看出,某一個毒株如果對牛易感,對豬較為鈍感,則易于控制,如2005~2009年Asia1型江蘇毒株、2009—2010年A型武漢毒株等。相反,某一個毒株如果對豬易感,則難于在短期內(nèi)控制,如CATHAY拓?fù)湫投局旰蚆ya-98毒株。因此,從Mya-98毒株目前流行潛力和對豬的易感性、致病力等方面綜合分析,該毒株在我國還將持續(xù)流行一段時期。國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室開展的全國重點(diǎn)省份豬屠宰場口蹄疫監(jiān)測結(jié)果也表明,我國豬群中Mya-98毒株較為常見,如2010年全國19省口蹄疫監(jiān)測中,在4個省市自治區(qū)屠宰場監(jiān)測到陽性帶毒;2012年全國10省豬屠宰場監(jiān)測中,在3個省監(jiān)測到豬帶毒陽性。
2010年以來,新一輪Mya-98毒株傳入我國以來,引起了嚴(yán)重的疫情流行,給我國的養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的打擊,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自新毒株確診以來,國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室積極地投入對該毒株的研究和疫苗研發(fā)工作,并取得突破性進(jìn)展。針對該毒株的疫苗已經(jīng)投放市場,并取得了有效控制。2011年,我國發(fā)生2起Mya-98疫情,2012年發(fā)生3起,2013年僅發(fā)生2起,疫情次數(shù)(表1)和流行范圍(圖1)進(jìn)一步降低或減小??梢钥隙ǎ灰鷮?shí)做好免疫預(yù)防、流調(diào)監(jiān)測和流通環(huán)節(jié)監(jiān)管工作,一定可以有效控制該毒株的流行。
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