鄭小龍,朱來華,王 群,艾 軍,鄧明俊,肖西志,梁成珠,姜 帆,于業(yè)鋒
(1.山東出入境檢驗檢疫局,山東 青島 266002;2.云南出入境檢驗檢疫局,云南 昆明 650000)
非洲馬瘟(African horse sickness,AHS)是由非洲馬瘟病毒(African horse sickness,AHSV)引起的馬屬動物的一種急性和亞急性蟲媒傳染病[1-2]。AHS可感染所有馬屬動物,但以馬最為易感,可引起動物發(fā)熱、皮下水腫及臟器出血,病死率可達90%以上。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定必須報告的動物疫病,我國將其列為一類動物傳染病。
AHS主要分布在非洲大部,另外在地中海周邊國家、中東、歐洲等也有發(fā)生,近年來該病已經(jīng)在亞洲個別國家相繼出現(xiàn),目前我國尚未有AHS感染的報道,但隨著世界經(jīng)濟及我國對外貿(mào)易的快速發(fā)展以及賽馬參加國際比賽的機會增多,該病進入我國的風險也隨之增大。
目前已發(fā)現(xiàn)AHSV有9個血清型[3-4],其病毒基因組包含10個dsRNA片段,編碼7個結構蛋白和3個非結構蛋白[5-6]。其中VP7結構蛋白為主要的內(nèi)衣殼蛋白,并已證實其為AHSV的群特異性抗原[7-8],可檢測到9個AHSV血清型的抗體。本文利用VP7重組蛋白建立了檢測AHS的IgM 捕獲ELISA(MAC-ELISA)方法,為非洲馬瘟早期感染的診斷提供了技術手段。
1.1.1 質(zhì)粒及特異血清 VP7原核表達質(zhì)粒由云南檢驗檢疫技術中心惠贈;陽性血清、陰性血清購自英國動物衛(wèi)生研究所(IAH)。
1.1.2 試劑 T載體、DNA連接酶 、限制性內(nèi)切 酶 Bam HI、Xho I、DNA marker, 購自大連Takara公司;rTaq DNA聚合酶、RT-PCR Taqmix、RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自QIAGEN公司; His-Bind?Purif i cation Kit為 Novagen公司產(chǎn)品;瓊脂糖、IPTG和DAB顯色試劑盒購自上海生工公司;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司;羊抗馬IgM購自Abcam公司;其它試劑均為分析純。
1.2.1 VP7表達載體的構建
李富祥[9]等根據(jù)VP7基因設計了一對引物用于擴增和鑒定VP基因,上游引物AH1:5’-CCC TCTAGAATGGACGCGATAGCAGCAAAG-3’(下劃線部分為Xba I酶切位點),下游引物AH2:5’-GGGAAGCTTCTAGTGGTAGGCTGCTAGC AC-3’(下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點),擴增片段長度為1080bp。將擴增片段插入PET-32a表達載體中,構建pET-VP7表達質(zhì)粒。
1.2.2 陽性轉化菌的誘導表達
將質(zhì)粒轉入表達菌中,然后接種于含100mmol/mL Amp的LB培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日以10%的量接種于含Amp的LB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4~0.6時分別加入1.0mmol/L的IPTG進行誘導培養(yǎng)5h,取樣進行SDS-PAGE電泳鑒定。
1.2.3 表達產(chǎn)物的Western-blot鑒定
將經(jīng)誘導表達的菌液處理后進行SDS-PAGE電泳,按《分子克隆實驗指南》介紹的方法進行轉印及反應,一抗采用AHSV-1型陽性血清,二抗為羊抗馬IgG-HRP。用DAB試劑顯色。
1.2.4 重組蛋白質(zhì)His-Bind柱純化
根據(jù)Novagen公司的His-Bind? Purif i cation Kit說明書進行,取不同時間的洗脫液進行電泳鑒定分析。
1.2.5 多克隆抗體的制備與標記
1.2.5.1 多克隆抗體的制備
將純化后的 pET-VP7蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻,頸部皮下注射家兔(100μg/只),兩周后注射弗氏不完全佐劑與蛋白的混合液,以后每隔兩周注射一次,共免疫注射 3次后采血,收集的血清即為多克隆抗體, 用 ELISA 方法測定其效價。
1.2.5.2 多克隆抗體標記
采用Sigma HRP標記試劑盒(P8415)標記多克隆抗體。結合物酶活性和免疫反應性的鑒定,采用直接ELISA法與相應抗原進行反應,即將酶標抗體按1:103,1:104,1:105,1:106稀釋后直接與ELISA板上包被的pET-VP7進行反應,測定酶標抗體的效價并選擇其最佳工作濃度。
1.2.6 VP7抗原和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定
1)將羊抗馬IgM用包被緩沖液作1:400稀釋,加入酶標板,每孔100μL,4℃包被過夜。
2)用洗液洗板3次,加入封閉液,每孔200μL,37℃ 2h。
3)用洗液洗板3次,將陰性和陽性血清按照1:50,1:100,1:200,1:400,1:800稀釋,每孔加100μL,37℃ 1h。
4)用洗液洗滌3次,加入pET-VP7抗原1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200,1:6400, 每孔加100μL,37℃ 1h。
5) 用洗液洗滌3次,加入HRP標記的pETVP7(1:10000)抗體,每孔加100μL,37℃ 1h。
6)用洗液洗滌3次,每孔加100μLTMB,37℃ 避光 10min。
7)加入終止液,每孔加100μL,450nm讀數(shù)。
從數(shù)值中找出OD值在1.0左右,且陽性血清OD值比陰性血清OD值(P/N值)最高的作為最適稀釋度。
1.2.7 酶標抗體最佳稀釋倍數(shù)的確定
按照1.2.5中確定的抗原及血清最佳稀釋倍數(shù),進行試驗。將抗酶標抗體作1:5000,1:10000,1:20000,1:50000,1:100000稀釋,按照上述步驟進行試驗,確定最佳稀釋倍數(shù)。
1.2.8 特異性評價
應用建立的捕獲ELISA方法對AHSV陽性血清(1-9型)、AHSV陰性血清、馬動脈炎陽性血清、馬動脈炎陰性血清、馬鼻肺炎陽性血清、WEEV陽性血清、WEEV陰性血清進行檢測,評價所建立方法的特異性。
1.2.9 重復性和穩(wěn)定性評價
根據(jù)批內(nèi)和批間的變異系數(shù)來評價捕獲ELISA方法的穩(wěn)定性。批內(nèi)差異:使用同一批次包被的酶標板對3份血清進行檢測,每份血清設置4個重復,計算其變異系數(shù);批間差異:取4次不同時間包被的酶標板,同時對1份血清進行檢測,每塊板上設置3個重復孔,計算變異系數(shù)。
1.2.10 建立的捕獲ELISA方法與進口試劑盒比較
選取180份馬血清樣品,同時用建立的捕獲ELISA與進口試劑盒進行平行檢測,對檢測結果進行比較分析。
將表達蛋白用His-Bind層析柱純化。取不同時間的洗脫樣品進行鑒定,由圖1可知目標蛋白仍有較高的濃度,盡管存在極少量的雜蛋白,但目標蛋白占有絕對多的含量,表明純化效果達到預期的目的。應用BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)檢測純化蛋白含量為500μg/mL。
圖1 表達產(chǎn)物的分離與純化
經(jīng)Western-blot 檢測,在目標條帶所處的位置(54kD左右)出現(xiàn)一條印跡(圖2),表明表達產(chǎn)物具有良好的抗原性。
圖2 表達產(chǎn)物的免疫印跡分析
免疫三次后采血,分離血清,將待檢血清進行10倍系列梯度稀釋,ELISA法檢測血清中抗體水平(樣品設平行)。結果顯示,經(jīng)過三次免疫后pETVP7抗體的滴度大于10-7。將純化好的血清用Sigma試劑盒進行標記,標記后直接ELISA法進行特異性檢測得知,HRP標記的抗pET-VP7抗體的工作濃度為104~105,詳細工作濃度按具體試驗而定。
根據(jù)試驗結果可知:當抗原 1:800稀釋,血清1:100稀釋時,陽性對照OD值為1.0左右,且P/N的值最大,因此我們選定抗原的稀釋倍數(shù)為1:800(0.625μg/mL),血清最佳稀釋倍數(shù)為1:100。
將羊抗馬IgM作1:400稀釋包被酶標板,血清1:100稀釋,抗原1:800,進行試驗。結果表明當酶標抗體1:10000稀釋時,陽性對照OD值為1.1左右,且P/N的值最大,因此,酶標抗體最佳稀釋倍數(shù)為1:104。
對已知的AHSV陽性和陰性血清進行檢測,10份陽性血清均P/N≥2.1,30份陰性血清值均P/N<2.1,根據(jù)試驗結果,將P/N≥2.1界定為陽性,P/N<2.1界定為陰性。
應用建立的捕獲ELISA方法對AHSV陽性血清、AHSV陰性血清、馬動脈炎陽性血清、馬動脈炎陰性血清、馬鼻肺炎陽性血清、WEEV陽性血清、WEEV陰性血清進行檢測,結果顯示,該方法能夠檢測出AHSV陽性血清(1-9型),特異性高,與其他病毒陽性血清無交叉反應。
應用所建立的捕獲ELISA方法進行批內(nèi)和批間重復試驗,計算其變異系數(shù)。批內(nèi)重復試驗結果顯示變異系數(shù)分別為2.31%、1.29%、4.01%;批間重復試驗結果顯示變異系數(shù)為6.21%;結果顯示批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10%,說明本試驗建立的ELISA方法具有較好的穩(wěn)定性。
取180份馬血清樣品分別用進口試劑盒和本研究建立的捕獲ELISA進行檢測,結果顯示,進口ELISA試劑盒檢測出的14份陽性樣品中,捕獲ELISA檢測10份為陽性,4份為陰性;進口ELISA檢測166份陰性的樣品,捕獲ELISA檢測170份為陰性。兩種ELISA均為陽性的為10份,均為陰性的為166份,因此總符合率為97.7%。
由于非洲馬瘟目前在我國還沒有疫情發(fā)生的報道,因此我國在對該病的防控方面目前還沒有具體的措施,也沒有自主產(chǎn)權的非洲馬瘟疫苗和診斷試劑。為了防止國外疫情傳入我國,盡早開展對非洲馬瘟診斷試劑的研制,建立簡便、快速、特異、靈敏的檢測技術,對我國新興馬業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。
因為IgM抗體在機體感染后最早出現(xiàn)(7-10天),因而是早期感染的重要標志性抗體。MACELISA是對常規(guī)的直接或間接ELISA的重要改進,包被抗IgM抗體的微量板可以捕獲樣品中所有類型IgM,而不同病原微生物感染僅產(chǎn)生各種特異性的IgM抗體,可結合其自身特異性微生物。在進行MAC-ELISA,只需要加入特定的抗原,就可以檢測特定的動物疾病,具有廣闊的通用性。而且IgM是早期感染引起的抗體,MAC-ELISA是早期感染診斷的重要工具,早期診斷意義重大,可以迅速采取檢疫、防疫措施,避免疫情進一步擴散。
本文通過對抗原濃度、血清稀釋度、酶標抗體稀釋度等條件進行摸索,最終確定了最佳的反應濃度及稀釋度。特異性試驗結果顯示,本文建立的MAC-ELISA方法僅能檢測出AHSV陽性血清,特異性高,與其他病毒陽性血清無交叉反應。重復性及穩(wěn)定性試驗結果顯示,批內(nèi)和批間試驗的變異系數(shù)均小于10%,說明本試驗建立的ELISA方法具有較好的穩(wěn)定性。在與進口試劑盒進行比對時,進口試劑盒檢測出的4份陽性樣品,捕獲ELISA檢測為陰性,且無法用其他方法(如中和試驗等)進行驗證,存在假陰性的問題,可能與血清采集期有關,感染后期采集的血清中IgM含量會降低。
本文建立的MAC-ELISA方法特異性強,可用于早期病毒感染產(chǎn)生的IgM抗體的檢測,且適用范圍較廣,符合出入境動物檢疫、國內(nèi)疫病疫情快速檢測的需要,為早期感染的診斷提供了一種簡便、快速、特異、靈敏的檢測手段。
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