燕傲蕾，葛永斌，郭 慧

亳州師范高等專科學(xué)校理化系，安徽亳州，236800

自由基是生物代謝過(guò)程中出現(xiàn)的中間產(chǎn)物，過(guò)量自由基會(huì)攻擊生物分子不飽和位點(diǎn)，損傷DNA、蛋白質(zhì)等有機(jī)分子，引起細(xì)胞代謝紊亂。在現(xiàn)代快節(jié)奏的生活方式和日光、紫外線、電離輻射等外部不良條件的影響下，人體產(chǎn)生的自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)已成為加速細(xì)胞衰老、引發(fā)多種疾病的重要因素［1］，機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱與其健康程度密切相關(guān)，食品抗氧化能力的強(qiáng)弱也成為評(píng)價(jià)其保健能力的重要指標(biāo)［2］。

啤酒是廣受大眾喜愛的休閑飲品，含有800多種有機(jī)、無(wú)機(jī)化合物，具有一定的抗氧化功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［3］。亳菊啤酒兼具啤酒獨(dú)特風(fēng)味和菊花清新適口的特點(diǎn)，且由于亳菊所含的金合歡素、木犀草素等成分的融入，使啤酒具備了亳菊所具備的營(yíng)養(yǎng)保健功能。研究亳菊啤酒的抗氧化性不僅對(duì)提高啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性有積極意義，而且對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能的評(píng)價(jià)也具有重要的參考價(jià)值［4］。由于亳菊啤酒中成分復(fù)雜，抗氧化物質(zhì)眾多，單獨(dú)使用一種方法不能準(zhǔn)確反映樣品的總抗氧化活性［5］，因此，本實(shí)驗(yàn)采用TRAP、DPPH、ABTS和羥自由基清除四種方法對(duì)亳菊啤酒的體外抗氧化性進(jìn)行研究，以綜合評(píng)價(jià)其抗氧化能力，為亳菊啤酒的進(jìn)一步研究和開發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV759型紫外－可見分光光度計(jì)，購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司。

安徽亳州當(dāng)年產(chǎn)的一級(jí)亳菊（Chrysanthemum morifolium（Ramat.）Tzvel CV.），購(gòu)自亳州市中藥材交易中心。1，1－二苯基－2－苦基苯肼（DPPH，1－diphenyl－2－picryl hydrazyl）、2，4，6－三（2－吡啶基）－1，3，5－三丫嗪（TPTZ，2，4，6－Tris（2－pyridyl）－s－triazine）、2，2＇聯(lián)氨－雙（3－乙基苯并噻唑琳－6－磺酸〉二胺鹽（ABTS，2，2－Azinobis（3－ehtylbenzothiazolin－6－sulfnic Acid）Diammonium Salt）購(gòu)自Sigma公司，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純（AR）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亳菊啤酒生產(chǎn)工藝

在啤酒后酵前期加入亳菊水提液，使亳菊啤酒中亳菊的濃度分別為1、2、3、4、5mg／L（以亳菊干重計(jì)），并設(shè)一罐不加亳菊的普通啤酒作為對(duì)照，具體工藝流程參見葛永斌的方法［6］。

1.2.2 亳菊啤酒體外抗氧化性測(cè)定

鐵還原／抗氧化能力（FRAP）法測(cè)定總還原力參照Benzie的方法［7］，并略有改動(dòng)。按0.1mol／L醋酸緩沖試劑（pH3.6）∶10mmol／L TPTZ∶20mmol／L氯化鐵＝10∶1∶1（體積比）的比例混合制成FRAP試劑，取稀釋2倍后的亳菊啤酒0.1mL與3.9mL FRAP溶液混勻，37℃水浴10min后，在593nm處測(cè)定吸光值。以1.0mmol／L硫酸亞鐵為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品抗氧化活性（FRAP值）。

DPPH·清除實(shí)驗(yàn)在Gorinstenin的方法［8］上略作調(diào)整。將亳菊啤酒稀釋5倍后，取0.3mL與2.7mL0.2mmol／L的 DPPH 乙醇溶液混勻，暗處反應(yīng)30min后在517nm處進(jìn)行吸光度A1的測(cè)定。以0.3mL無(wú)水乙醇與2.7mL0.2mmol／L的 DPPH乙醇溶液的混勻物為空白對(duì)照測(cè)定吸光度A0。

DPPH·清除率（%）＝［（A0－A1）／A0］×100%（1）式中，A0為空白組吸光值；A1為樣品組吸光值。

ABTS＋·清除實(shí)驗(yàn)參照Re的方法［9］并稍作修改。將140mmol／L的過(guò)硫酸銅和7mmol／L的ABTS＋·溶液按11∶625的體積比充分混合后，避光反應(yīng)12～16h制成ABTS＋·儲(chǔ)備液，測(cè)定前用無(wú)水乙醇將儲(chǔ)備液稀釋，得到在734nm處吸光值為0.700±0.002的ABTS＋·工作液。取稀釋5倍后的亳菊啤酒0.3mL與2.7mL ABTS＋·工作液充分混合，室溫條件下反應(yīng)10min，以0.3mL蒸餾水與ABTS＋·工作液的混勻液為空白，在734nm處測(cè)定吸光值。ABTS＋·清除率按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

羥自由基（·OH）清除實(shí)驗(yàn)參照恭菁華的方法［10］，并適當(dāng)修改。取稀釋2倍后的亳菊啤酒1 mL，加 8.8mmol／L H2O2、9mmol／L FeSO4、9 mmol／L水楊酸－乙醇溶液各1mL，混勻后靜置30min，以蒸餾水為空白對(duì)照，在510nm處測(cè)定吸光度，·OH清除率的計(jì)算同式（1）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，并用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度亳菊啤酒的總抗氧化活性

在酸性條件下，TPTZ可以與Fe3＋形成復(fù)合物（Fe3＋－TPTZ），在 還 原 性 物 質(zhì) 作 用 下，F(xiàn)e3＋－TPTZ會(huì)被還原成Fe2＋，從而使溶液呈現(xiàn)為藍(lán)色且在593nm處達(dá)到最大吸收，還原物質(zhì)的含量與其吸光度間存在比例關(guān)系。FRAP法不僅原理明確、標(biāo)準(zhǔn)化程度高、操作便捷，而且能避免自由基類型不同所引起的差異，是反映樣品總抗氧化活性的常用方法［11］。

不同濃度亳菊啤酒的總還原力如圖1所示（不同的字母表示存在顯著性差異，P＜0.05，下同），隨著亳菊添加濃度的上升，亳菊啤酒的總還原力也在不斷升高，亳菊濃度為1、2、3、4、5g／L的亳菊啤酒總還原力分別為對(duì)照組的1.35、1.87、2.19、2.51和2.75倍，且各組間均存在顯著差異（P＜0.05）?？梢?，添加亳菊可以顯著提高啤酒的總還原力。但是，增加亳菊所引起的總還原力的增幅卻表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)亳菊添加濃度為2g／L時(shí)，增幅最大，比1g／L亳菊啤酒的總還原力高了20.54；當(dāng)亳菊添加濃度為3、4g／L時(shí)，總還原力的增幅穩(wěn)定在12左右；當(dāng)亳菊添加濃度為5g／L時(shí)，亳菊啤酒的總還原力僅比4g／L組高了9.84?？梢姡?dāng)亳菊添加濃度較低時(shí)，增加亳菊濃度可以顯著提高成品啤酒的總還原力，但隨著添加濃度的上升，這種提升效果越來(lái)越弱。

圖1 不同濃度亳菊啤酒的總還原力

2.2 不同濃度亳菊啤酒的DPPH·清除能力

DPPH法自1958年出現(xiàn)后，廣泛用于食品和生物試樣抗氧化能力的定量測(cè)定。該法主要是利用DPPH·中存在單電子，在醇溶液中能形成穩(wěn)定的含氮自由基并呈典型紫色，在517nm處有強(qiáng)吸收的特點(diǎn)，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，孤對(duì)電子配對(duì)，從而使溶液的紫色消退、吸收減弱，變化程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系［12］。DPPH法可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析，在體外檢測(cè)抗氧化劑清除自由基方法中最為常見，可用于抗氧化成分的體外抗氧化性評(píng)價(jià)［13］。

從圖2可以看出，隨著亳菊添加濃度的上升，亳菊啤酒對(duì)DPPH·的清除率也表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，但上升幅度卻在逐漸變緩，亳菊添加濃度為1、2、3、4、5g／L時(shí)，亳菊啤酒對(duì)DPPH·的清除率分別為對(duì)照組的1.58、2.00、2.38、2.53、2.70倍，各濃度間DPPH· 清除 率分別增 加 19.55%、13.97%、12.85%、5.03%、5.59%，且3g／L與4g／L、4g／L與5g／L亳菊啤酒的DPPH·的清除率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這表明在亳菊添加濃度低于4g／L時(shí)，增加亳菊的量可以顯著提高產(chǎn)品對(duì)DPPH·的清除效果，但當(dāng)添加濃度達(dá)到4g／L以上，繼續(xù)提高亳菊濃度，對(duì)DPPH·清除的意義不大。

圖2 不同亳菊啤酒的DPPH·清除能力

2.3 不同濃度亳菊啤酒的ABTS＋·清除能力

Miller等［14］在1993年發(fā)表了用ABTS法評(píng)價(jià)樣品抗氧化活性的方法——ABTS在活性氧氧化下生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS＋·，在734nm處具有最強(qiáng)吸收，當(dāng)樣品中存在抗氧化物時(shí)，ABTS＋·的產(chǎn)生會(huì)被抑制，溶液顏色變淺，吸光值減少，測(cè)定此處吸光度的變化，可以表明樣品對(duì)ABTS＋·清除能力的強(qiáng)弱。該方法在測(cè)定食品和飲料類抗氧化活性中廣泛使用［15］。

不同濃度亳菊啤酒的ABTS＋·清除能力如圖3所示。亳菊啤酒的ABTS＋·清除率隨著亳菊添加濃度的升高而上升，添加濃度為1、2、3、4、5g／L的亳菊啤酒對(duì)ABTS＋·的清除能力分別為對(duì)照組的1.12、1.28、1.43、1.54和1.63倍，且各組間均存在顯著差異（P＜0.05）。同F(xiàn)RAP法測(cè)定的總還原力情況類似，增加亳菊所引起的ABTS＋·清除率的增幅表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)亳菊添加濃度為2g／L時(shí)，增幅最大，比1g／L組的清除率提高了3.50%，當(dāng)亳菊添加濃度達(dá)到3、4、5g／L 時(shí)，ABTS＋·清除率分別比2、3、4g／L組高了2.29%、2.20%和2.07%?？梢姡?dāng)亳菊添加濃度達(dá)到4g／L以上，亳菊添加濃度的進(jìn)一步提升對(duì)啤酒總還原力的影響變小。

圖3 不同濃度亳菊啤酒的ABTS＋·清除能力

2.4 不同濃度亳菊啤酒的·OH清除能力

·OH是最活躍的活性分子，也是進(jìn)攻性最強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)之一，可通過(guò)電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)多種分子作用，導(dǎo)致生物體組織脂質(zhì)過(guò)氧化，蛋白質(zhì)解聚、聚合，核酸斷裂，多糖解聚，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，引發(fā)細(xì)胞凋亡、壞死和突變，并與腫瘤、輻射損傷等有關(guān)，是目前所知活性氧自由基中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的類型［16－17］，清除·OH能力的強(qiáng)弱可作為評(píng)價(jià)食品保健功能的重要指標(biāo)。

從表4可以看出，隨著亳菊添加濃度的上升，亳菊啤酒對(duì)·OH的清除能力有了很大的提高，分別為對(duì)照組的1.60、2.16、2.47、2.82、3.10倍，且各組間均存在顯著差異（P＜0.05），添加亳菊對(duì)提高啤酒·OH的清除具有顯著的促進(jìn)作用。亳菊添加濃度為1、2、3、4、5g／L的亳菊啤酒，對(duì)·OH 的清除率比對(duì)照組、1、2、3、4g／L 組分別高了13.96%、12.75%、7.23%、7.89%、6.56%，隨著亳菊添加 濃度的上升，啤酒的·OH清除能力的增長(zhǎng)速度在逐漸下降。

圖4 不同濃度亳菊啤酒的·OH清除能力

3 結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)以上研究可以看出，雖然用不同方法評(píng)價(jià)亳菊啤酒的抗氧化性存在一定的差異，但均反映出添加亳菊水提液制備亳菊啤酒能顯著提高成品啤酒的抗氧化性，并對(duì)機(jī)體中危害最大的羥自由基清除效果良好。因此，從抗氧化角度來(lái)說(shuō)，亳菊的添加為啤酒增加了保健功能。但同時(shí)也注意到，在亳菊添加濃度較低時(shí)，增加亳菊對(duì)提高成品啤酒抗氧化能力效果良好，但當(dāng)亳菊濃度達(dá)到一定水平后，抗氧化能力的提升速度卻逐漸下降，亳菊添加濃度在2～4 g／L最為適宜。這也與之前的研究［6］“能保證亳菊啤酒質(zhì)量、風(fēng)味、適口度并體現(xiàn)菊花清香的亳菊添加量”是基本相符的。

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