王建升 呂元鵬 孟軍濤 宋津曉 張立志 帖彥清

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的一類惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多階段的過程，在這個過程中已證實有細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的嚴(yán)重失衡，如結(jié)直腸癌患者有Th1相關(guān)的細(xì)胞因子向Th2相關(guān)的細(xì)胞因子漂移。而且血清中Th1/Th2相關(guān)的細(xì)胞因子在“腺瘤—腺癌”順序中的早期就出現(xiàn)明顯的異常，被認(rèn)為是評估臨床預(yù)后很重要的免疫學(xué)指標(biāo)［1］。

IL-23和IL-17是一類促炎性細(xì)胞因子，參與了腦、肺、皮膚和胃腸道等多種組織的慢性炎癥［2］。盡管IL-23在Th17細(xì)胞的初始分化中并不起主要作用，但其存在卻有利于維持Th17細(xì)胞的增殖和存活，IL-23的缺失可使Th17細(xì)胞產(chǎn)生其特征因子IL-17的能力大大減低［3］。最近的證據(jù)表明IL-23/IL-17軸也參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4-5］。為探討IL-23/IL-17軸在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的作用，本研究用ELISA檢測了結(jié)直腸癌患者外周血，正常黏膜組織和腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-23和IL-17水平的變化情況，并分析其與臨床病理特征的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

標(biāo)本來源于河北省人民醫(yī)院2010年6月至2013年3月結(jié)直腸腺癌患者56例，其中男28例、女28例；年齡43～86歲，平均（65.1±11.6）歲。全部患者的標(biāo)本在收集前均未行放療、化療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療。所有病例均經(jīng)病理診斷證實且確定其病理分型。選擇健康志愿者24例為對照，男12例、女12例；年齡42～83歲，平均（63.3±11.9）歲。所有受試者均簽署知情同意書，并報倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

受試對象于清晨抽取空腹外周血5 mL，3 000轉(zhuǎn)/分離心，取血清儲存于-80°C以備用。正常黏膜組織和癌組織來自29例手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者，其中正常黏膜組織至少遠(yuǎn)離癌組織5 cm。將新鮮分離的正常黏膜組織和腫瘤組織分別剔取脂肪和血塊后，稱重，用含雙抗的D-Hank's液清洗3次，用手術(shù)剪將組織剪成小塊，放入24孔培養(yǎng)板中，往每孔加入含雙抗的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，置于37°C，CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)液于離心管中，13 500轉(zhuǎn)/分，離心，吸取上清液儲存于-80°C以備用。用雙抗體夾心法進(jìn)行人IL-17和IL-23的ELISA檢測。操作過程均按ELISA試劑盒（eBioscience）說明書進(jìn)行。細(xì)胞因子的濃度以pg/mL表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用表示。計量資料采用t檢驗；相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者和健康對照外周血中IL-23和IL-17水平的檢測

結(jié)直腸癌患者血清中IL-23和IL-17水平顯著高于健康對照組（表1）。結(jié)直腸癌患者血清中IL-17水平與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無關(guān)（P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期（直腸）呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），即有淋巴轉(zhuǎn)移者IL-17水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，IL-17水平隨著TNM分期（直腸）增加反而減少。另外，也發(fā)現(xiàn)血清中IL-17水平與腫瘤位置有關(guān)，即在結(jié)腸（升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸）中的表達(dá)水平高于直腸或乙狀結(jié)腸（P＜0.05）。結(jié)直腸癌患者血清中IL-23水平與患者的各項臨床病理參數(shù)無相關(guān)性（P＞0.05，表2）。

2.2 結(jié)直腸癌患者正常黏膜組織和腫瘤組織中IL-23和IL-17水平的檢測

結(jié)直腸癌患者腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-23和IL-17水平高于正常黏膜組（表1）。結(jié)直腸癌患者腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-17水平與患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)（P＜0.05）。但腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-17水平還與腫瘤的分化程度有關(guān)，即低分化者IL-17水平高于相應(yīng)的高、中分化者。結(jié)直腸癌患者腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-23水平與患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05），僅與TNM分期呈正相關(guān)（P＜0.05，表3）。

表1 結(jié)直腸癌患者和對照組外周血及患者的正常黏膜組織與腫瘤組織中IL-23和IL-17濃度Table 1 Levels of IL-23 and IL-17 in peripheral blood of CRC patients，healthy subjects，cultured normal tissues，and tumor tissues from CRC patients

表2 結(jié)直腸癌患者血清中IL-17和IL-23水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 Associations of serum IL-17 and IL-23 with clinico-pathological parameters in CRC patients

表2 結(jié)直腸癌患者血清中IL-17和IL-23水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 （續(xù)表2）Table 2 Associations of serum IL-17 and IL-23 with clinico-pathological parameters in CRC patients （Continued table 2）

表3 結(jié)直腸癌患者腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-17和IL-23水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 3 Associations of tumor supernatant IL-17 and IL-23 with clinico-pathological parameters in CRC patients

2.3 結(jié)直腸癌患者外周血和腫瘤組織中IL-23和IL-17相關(guān)性分析

結(jié)直腸癌患者外周血和腫瘤組織中IL-23水平分別與IL-17水平呈正相關(guān)（圖1）。

圖1 結(jié)直腸癌患者外周血和腫瘤組織中IL-23和IL-17水平的相關(guān)性Figure 1 Correlations between the levels of IL-23 and IL-17 in periph?eral blood（A）and tumor tissues（B）of CRC patients

3 討論

IL-23和IL-17是一類促炎性細(xì)胞因子，其不但參與了慢性炎癥和多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，而且也參與了腫瘤相關(guān)的炎性反應(yīng)和腫瘤的發(fā)展［4-5］。IL-23被認(rèn)為是腸道炎性反應(yīng)的始動者，能引起炎性細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，致腸道中IL-17、IL-6、IL-22表達(dá)水平增高，從而加劇炎性反應(yīng)［6］。IL-23也被看做一種與癌相關(guān)的細(xì)胞因子，如上調(diào)MMP-9的表達(dá)，增強(qiáng)血管的形成，阻止殺傷性T細(xì)胞的浸潤及抑制其功能的發(fā)揮，從而促進(jìn)腫瘤的生長［7］。IL-17能增強(qiáng)炎性細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-23的表達(dá)，從而加劇炎性反應(yīng)［8-9］。IL-17能刺激結(jié)腸癌細(xì)胞分泌VEGF而間接促進(jìn)血管的形成，通過抑制CD8+T細(xì)胞和增強(qiáng)髓系來源的抑制細(xì)胞（myeloid-derived sup?pressor cells，MDSCs）進(jìn)入腫瘤組織而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，它在結(jié)腸癌患者的表達(dá)增多預(yù)示患者的不良預(yù)后［10-11］。在產(chǎn)生腸毒素的脆弱類桿菌（ETBF）引發(fā)的腸炎和結(jié)腸癌鼠模型中，ETBF能引起較強(qiáng)的Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎性免疫反應(yīng)，這種炎性反應(yīng)導(dǎo)致腸炎和結(jié)腸腫瘤的形成，用抗體阻斷IL-17和IL-23受體，就能抑制ETBF引發(fā)的腸炎和結(jié)腸腫瘤的發(fā)生，表明IL-23/IL-17軸在炎性腸癌的發(fā)生中起主要作用［12］。

有研究者檢測了結(jié)直腸癌患者外周血或腫瘤組織中IL-17和IL-23的表達(dá)情況，然而可能是由于不同研究者所使用技術(shù)手段不同或所收集的生物樣品的差異，各個的檢測結(jié)果常常不一致。W?gs?ter等［13］用ELISA檢測IL-17在結(jié)直腸癌患者正常組織、腫瘤組織及患者和健康對照外周血中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IL-17在這幾組間并無統(tǒng)計學(xué)差異，且外周血和腫瘤組織中IL-17水平與患者的年齡、性別及Duke分期無相關(guān)性，故認(rèn)為IL-17在結(jié)直腸癌中所起的作用不大。Cui等［14］發(fā)現(xiàn)盡管進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織中IL-17表達(dá)高于早期患者，但二者并無統(tǒng)計學(xué)差異，腫瘤組織中IL-17水平與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及Duke分期無相關(guān)性。但Radosav?ljevic等［15］則發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者血清中IL-17水平明顯高于健康對照，推測患者外周血IL-17水平升高是由于腫瘤組織產(chǎn)生的IL-17釋放入血而致，故作者認(rèn)為IL-17可作為一個診治結(jié)直腸癌有價值的腫瘤標(biāo)志物。國內(nèi)資料表明，結(jié)直腸癌患者外周血中IL-17水平和結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其水平隨著結(jié)直腸癌的進(jìn)展和腫瘤負(fù)荷的增加而升高［16-17］。Stanilov等［18］表明結(jié)直腸癌患者外周血中IL-23水平高于健康對照，腫瘤組織中IL-23p19 mRNA表達(dá)水平也高于相應(yīng)的自身正常黏膜組織。結(jié)直腸癌患者在化療前后血液中仍保持高水平的IL-23，但其并不與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，其病理意義目前不是太清楚［19］。本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌患者外周血中IL-17和IL-23水平明顯高于健康對照，腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-17和IL-23水平也高于相應(yīng)的正常黏膜組織。通過對結(jié)直腸癌患者IL-17和IL-23水平與臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)外周血中IL-17水平與腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期（直腸）呈負(fù)相關(guān)，而腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-17水平與腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)。外周血中IL-23水平與患者各項臨床病理參數(shù)無相關(guān)性，但腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-23水平僅與TNM分期呈正相關(guān)。相關(guān)性分析表明，結(jié)直腸癌患者外周血和腫瘤組織中IL-23水平分別與IL-17水平呈正相關(guān)，暗示IL-23/IL-17軸可能參與了結(jié)直腸癌進(jìn)展的免疫病理過程。另外，發(fā)現(xiàn)外周血和腫瘤組織中IL-17和IL-23水平在結(jié)直腸癌進(jìn)展中變化趨勢不一致，這一結(jié)果也提示僅檢測外周血中細(xì)胞因子的變化情況是不能準(zhǔn)確反映組織局部細(xì)胞因子的分泌狀況，只有聯(lián)合檢測外周血和組織中的細(xì)胞因子水平才能清晰且全面地反映在疾病進(jìn)展中細(xì)胞因子的變化情況。

總之，更好地了解IL-23/IL-17軸在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中作用，將能大大激勵更深入對結(jié)直腸癌發(fā)展中免疫機(jī)理的研究和探索，也有助于為該類疾病的特異性防治及從免疫調(diào)節(jié)的角度治療此類疾病提供新的思路。

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